液相色譜結(jié)合多元統(tǒng)計分析多酚與煙葉香型的關(guān)系

陳森林 黃曼艷 林云 陶紅 胡玉玲 葉為民 李攻科

摘?要?采用超聲輔助萃取-液相色譜法快速測定煙葉中8種多酚類致香前體物質(zhì)，通過測定51份煙葉樣品中多酚類含量差異，結(jié)合主成分分析、聚類分析和判別分析等多元統(tǒng)計方法，對煙葉香型進(jìn)行區(qū)分和判定。結(jié)果表明，前兩個主成分累計貢獻(xiàn)率為67.9%，從主成分得分圖中可直觀顯示清香型、中間香型和濃香型的分類趨勢，采用層次聚類分析可將51份煙葉樣品分為3種香型，與交互驗(yàn)證率為90.2%的Fisher's判別分析的結(jié)果相一致。此外，研究了多酚類物質(zhì)與產(chǎn)地的關(guān)系，主成分得分圖中初步顯示了不同產(chǎn)地?zé)熑~的分類趨勢。本研究結(jié)果表明，多酚類物質(zhì)結(jié)合多元統(tǒng)計方法可應(yīng)用于煙葉香型、產(chǎn)地分類的分析。

關(guān)鍵詞?液相色譜; 多元統(tǒng)計; 多酚; 煙葉; 香型; 產(chǎn)地

1?引 言

煙葉香型是影響煙葉品質(zhì)的重要因素，研究不同煙葉的香型，可為煙葉的品質(zhì)提供保障。煙葉香型主要分為清香型、濃香型、中間香型和過渡香型。小分子的致香成分（如糠醛、苯乙醇、大馬酮、2-乙?；量┑萚1]）是影響煙葉香型的直接因素，通過研究致香成分含量和組分變化，可以對煙葉香型[2]、產(chǎn)地[3]等進(jìn)行分類。多酚是煙草重要的次生代謝物和香氣前體物質(zhì)，包括單寧類、香豆素類、黃酮類、花色素類等，在陳化的過程中降解生成小分子致香成分（如苯甲酸、糠醛、5-甲基糠醛、4-甲基兒茶酚等[4]），從而影響煙葉的香型和品質(zhì)。

多酚類物質(zhì)測定方法主要有近紅外光譜法[5]、分光光度法[6]和色譜法[7]等。近紅外光譜法只能單一測定某種物質(zhì)，抗干擾能力弱， 且對痕量組分的定量分析不準(zhǔn)確; 分光光度法根據(jù)吸光度的大小對多酚進(jìn)行定量分析，對反應(yīng)要求高，穩(wěn)定性較差，更適合煙葉多酚總含量的測定; 高效液相色譜法具有穩(wěn)定性高，多組分同時檢測的優(yōu)勢，是煙葉中多酚類物質(zhì)測定的常用方法[8，9]。在煙葉多酚測定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法中[10]，僅測定了綠原酸、莨菪亭和蕓香苷3種多酚。為了全面研究煙葉多酚類物質(zhì)的組成，可以增加多酚類化合物的測定種類， 優(yōu)化前處理過程[11]和分析方法[12]。目前，采用儀器分析方法結(jié)合多元統(tǒng)計方法對煙葉香型、產(chǎn)地等信息分類和判定，是煙草行業(yè)重要的研究手段[13，14]。通過主成分分析（Principal component analysis，PCA）和聚類分析（Cluster analysis，CA）無監(jiān)督模式的識別方法，可以從主成分得分圖和聚類樹中直觀得出未知煙葉樣品的歸類情況[15，16]，但無法直接對未知樣品進(jìn)行預(yù)測和判定。因此，需要在大量已知樣品分類的基礎(chǔ)上建立判別模型，從而預(yù)測未知的煙葉樣品，如采用煙葉化學(xué)成分的特征光譜數(shù)據(jù)結(jié)合判別分析（Discriminate Analysis，DA）和偏最小二乘法（Partial Least squares method，PLS）對煙葉香型進(jìn)行區(qū)分[17]，或測定煙葉樣品致香成分含量的差異結(jié)合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對庫存煙葉香型進(jìn)行預(yù)測等[18]，均具有良好的識別效果。小分子致香成分是影響煙葉香型的直接因素，但煙葉致香前體物質(zhì)也是影響煙葉品質(zhì)的重要因素，Zhang等[19]研究了氨基酸、糖苷類成分含量差異， 采用層次聚類分析和偏最小二乘法分析不同生產(chǎn)時期和部位的煙葉樣品，從而為煙葉代謝過程分析提供依據(jù)。Xiang等[20]研究了煙葉中多酚和有機(jī)酸含量差異，結(jié)合多元統(tǒng)計分析，可對煙葉的產(chǎn)地、等級進(jìn)行分類。宗浩等[21]證明了煙葉多酚不僅與煙葉的部位有關(guān)，不同香型的多酚類物質(zhì)含量也有差異; 向剛等[22]建立了不同煙葉多酚類的指紋圖譜，為煙葉品質(zhì)的研究提供了依據(jù); 常愛霞等[23]研究了多酚類物質(zhì)與香型的相關(guān)性，結(jié)合聚類分析成功地對煙葉產(chǎn)地進(jìn)行了區(qū)分。

本研究建立了超聲輔助液液萃取-高效液相色譜快速測定煙葉中8種多酚類物質(zhì)的方法，采用主成分分析、聚類分析和判別分析法研究了以煙葉多酚類物質(zhì)含量差異對3種不同香型煙葉分類和判別的可行性，探究了煙葉多酚類物質(zhì)與產(chǎn)地的關(guān)系。研究結(jié)果表明，本方法具有良好的分類效果。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

LC-2010C高效液相色譜儀（日本島津公司），配紫外檢測器; H1850高速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)有限責(zé)任公司）; AB204-S電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）; KQ5200數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）; 0.22 μm聚四氟乙烯過濾器（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、莨菪亭、蕓香苷、莰菲醇-3-O-蕓香糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）; 甲醇（色譜純，DIMA公司）; 乙酸（色譜純，Sigma公司）; 煙葉樣品由廣東中煙公司提供。

2.2?色譜條件

Diamonsil C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）; 流動相A為0.5%乙酸溶液，流動相B為0.5%乙酸-甲醇溶液，梯度洗脫程序： 0～5 min， 80% B，5～35 min，80%～25% B; 柱溫： 30℃; 檢測波長328 nm; 進(jìn)樣量20 μL; 流速1 mL/min。

2.3?標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液制備

準(zhǔn)確稱取新綠原酸（8.8 mg）、綠原酸（23.5 mg）、隱綠原酸（10.2 mg）、咖啡酸（28.1 mg）、良菪亭（26.3 mg）、香豆素（33.7 mg）、蕓香苷（25.6 mg）、莰菲醇-3-O-蕓香糖苷（5.2 mg），用甲醇溶解并定容至25 mL，于4℃避光保存。配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時，采用逐級稀釋法配成一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

將烘干的煙葉樣品磨成粉末，過40目篩使用。稱取50 mg干燥后煙末樣品，加入10 mL甲醇-水（2∶3，V/V）搖勻，超聲提取20 min，以8000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，進(jìn)樣分析。

2.4?數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS-24軟件進(jìn)行主成分分析、層次聚類分析和判別分析。取51份不同香型煙葉樣品（具體信息見電子版文后支持信息表S1），其中，1～18號為清香型、19～35號為中間香型，36～51號為濃香型，各樣品的多酚類物質(zhì)平均含量請見電子版文后支持信息表S2; 另外，取53份不同產(chǎn)地（湖南、云南、貴州）的煙葉樣品，采用相同的方法對煙葉的產(chǎn)地進(jìn)行初步區(qū)分，其中1～22號產(chǎn)自湖南，23～42號產(chǎn)自云南， 43～53號產(chǎn)自貴州，各樣品的多酚類物質(zhì)平均含量請見電子版文后支持信息表S3。

3?結(jié)果與討論

3.1?色譜條件和前處理?xiàng)l件優(yōu)化

優(yōu)化了色譜流動相，流動相A和B分別采用0.5%乙酸溶液和0.5%乙酸-甲醇溶液時，方法具有良好的穩(wěn)定性和分離效果。對萃取溶劑比、超聲時間等前處理?xiàng)l件優(yōu)化，最終確定萃取溶劑為甲醇-水（2∶3， V/V），超聲時間為20 min，可簡單快速提取煙葉中的多酚類化合物。在最佳條件下的煙葉樣品色譜圖如圖1a，多酚類標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖1b。

3.2?方法評價

分別配制8種多酚類物質(zhì)的系列標(biāo)準(zhǔn)濃度，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析， 結(jié)果見表1。 8種多酚類物質(zhì)具有較寬的線性范圍，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.9990～0.9998，檢出限為0.0022～0.0044 mg/g，方法回收率為80.1%～104.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%～6.6%，滿足前處理和分析檢測方法的要求，可用于煙葉樣品中多酚類物質(zhì)的測定。

3.3?主成分分析

主成分分析（PCA） 是將多個變量通過線性變換以選出較少個數(shù)重要變量的多元統(tǒng)計分析方法，將原始數(shù)據(jù)降維后得到主要的因子變量，以降低數(shù)據(jù)的復(fù)雜度[24]。將得到的多酚類數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后進(jìn)行主成分分析，從因子載荷圖（圖2B）可見，8種多酚類物質(zhì)對煙葉香型的分類均具有重要作用，得到的主成分F1和F2是原8種多酚類物質(zhì)的線性組合。主成分得分圖（圖2A）中前2個主成分F1和F2累計貢獻(xiàn)率為67.2%，可將煙葉樣品分為3種不同的香型，且中間香型介于清香型和濃香型之間，存在一定的交叉結(jié)果，證明了根據(jù)多酚類物質(zhì)判別煙葉香型分類的可行性。從因子載荷圖（圖2B）可見，綠原酸及同分異構(gòu)體和蕓香苷含量是影響主成分F1的主要因素，且僅莨菪亭含量與F1呈負(fù)相關(guān);咖啡酸、莨菪亭和莰菲醇-3-O-蕓香糖苷含量是影響主成分F2的主要因素，且綠原酸和莰菲醇3-O-蕓香糖苷含量與F2呈負(fù)相關(guān)。主成分分析是一種無監(jiān)督的模式識別方法，忽略變量之間的相關(guān)性，通?？膳c聚類分析、判別分析聯(lián)用，增加結(jié)果的準(zhǔn)確性[25，26]。

3.4?聚類分析

聚類分析作為一種無監(jiān)督模式的分類方法，根據(jù)樣品含量的差異進(jìn)行歸類，將具有相似性質(zhì)的樣品歸為一類，從而在聚類樹圖中直觀看出每個樣品的分類信息，廣泛用于茶葉和煙葉品種和地域分類[27，28]。本研究采用The Ward系統(tǒng)聚類法，聚類距離采用歐氏距離，以51種煙葉樣品的酚類含量數(shù)據(jù)為變量，對3種不同香型的煙葉樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3所示，在T=9時，煙葉香型被分為三大類，其中一類是1～18號（除3、11號）煙葉樣品，另一類是19～35號（除25、29號）和43號樣品，其余的歸為第三類。與已知煙葉樣品的香型進(jìn)行對比，其分類的準(zhǔn)確率達(dá)到了90.8%，進(jìn)一步直觀地說明了根據(jù)煙葉多酚類含量的差異結(jié)合聚類分析可以對煙葉香型進(jìn)行分類，分類效果良好。

3.5?判別分析

判別分析作為一種監(jiān)督模式的識別方法，通過已知樣品的分類信息建立判別模型， 可以對未知樣品進(jìn)行預(yù)測和判定。以測得的多酚類物質(zhì)含量建立Fisher's判別模型， 對3種不同香型的煙葉進(jìn)行分類。從圖4判別分析得分投影圖中可以直觀看出組內(nèi)聚類情況和組間距離大小，3種香型的種群相對集中，基本上實(shí)現(xiàn)分離。分別運(yùn)用自身驗(yàn)證法和交互驗(yàn)證法對原樣品進(jìn)行回判，由于交互驗(yàn)證法采用刀切法進(jìn)行回代判別，有利于降低用全部數(shù)據(jù)建立判別函數(shù)后再對全部樣品進(jìn)行回代判別（即自身驗(yàn)證法）產(chǎn)生的偏差，運(yùn)用交互驗(yàn)證法常能得出較自身驗(yàn)證法更高的準(zhǔn)確率，增加可信度。煙葉樣品回代判別的結(jié)果見表2。在自身驗(yàn)證中，第1組清香型煙葉回代判別準(zhǔn)確率為94.4%，其中1份樣品誤判為第2組; 第2組中間香型回代判別準(zhǔn)確率為941%，其中1份樣品誤判為第3組; 第3組濃香型回代判別準(zhǔn)確率為100%，最終得出3組香型的平均準(zhǔn)確率為96.1%。同理計算出交互驗(yàn)證法的平均回代判別準(zhǔn)確率為90.2%。兩種驗(yàn)證方法證實(shí)了利用煙葉多酚類物質(zhì)含量的差異可對不同香型的煙葉樣品進(jìn)行判定，從而實(shí)現(xiàn)對某一未知香型的煙葉樣品的預(yù)測。

3.6?煙葉多酚類與產(chǎn)地關(guān)系的初步探究

測定了53份不同產(chǎn)地?zé)熑~樣品多酚類物質(zhì)的含量，其數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后，采用主成分分析法對煙葉產(chǎn)地進(jìn)行初步探究。 從圖5可見，提取的3個主成分的累計貢獻(xiàn)率為78.4%，3種地域有分類的趨勢，但是湖南煙葉主成分得分較分散，可能是因?yàn)楹系貐^(qū)的煙葉種植地區(qū)較分散，導(dǎo)致酚類含量的差異較大;其次， 還可以控制煙葉測定的部位，使測定的結(jié)果有更好的分類效果。圖5的結(jié)果初步表明，多酚類致香前體物質(zhì)與煙葉產(chǎn)地具有相關(guān)性。

4?結(jié) 論

采用超聲萃取-液相色譜法測定了煙葉中8種多酚類致香前體物質(zhì)，方法簡單快速，具有良好的穩(wěn)定性和精密度，可用于多酚類物質(zhì)測定。利用主成分分析、聚類和判別分析方法對多酚類物質(zhì)含量的差異進(jìn)行分析， 實(shí)現(xiàn)對煙葉的香型和地域的分類和判定，推測多酚類物質(zhì)與煙葉香型、產(chǎn)地的相關(guān)性，為煙葉香型和產(chǎn)地的研究提供了新的研究思路，從而為煙葉品質(zhì)研究提供更多的依據(jù)。

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