延展顯微鏡成像技術(shù)及其應(yīng)用

陳凱 張英春 趙關(guān)芳

摘?要?傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡由于光學(xué)衍射極限的限制，其分辨率不足，難以觀察亞細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)。自超分辨顯微技術(shù)提出以來，在細(xì)胞膜蛋白等單分子成像中得到廣泛運(yùn)用，并于2014年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。但這些超分辨技術(shù)多通過減少或避免處在激發(fā)體積內(nèi)的分子同時(shí)發(fā)射熒光來突破光學(xué)衍射。作為一種新型超分辨手段，延展顯微鏡具有成像時(shí)間短、可標(biāo)記密集生物大分子等優(yōu)勢。本文介紹了延展顯微鏡的成像原理和特點(diǎn)，對其在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，并對其發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞?延展顯微鏡; 超分辨成像; 凝膠; 評述

1?引 言

目前，顯微鏡已經(jīng)成為生命科學(xué)研究必不可少的工具。隨著研究的深入，許多亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)需要更高分辨率的顯微鏡。然而，點(diǎn)光源通過透鏡成像時(shí)，由于光學(xué)衍射會形成光斑，當(dāng)兩個(gè)點(diǎn)光源之間的距離很小時(shí)，其光斑會重疊，無法成像。因此，光學(xué)顯微鏡的分辨率存在極限。早在1873年德國物理學(xué)家Abbe就預(yù)言了光學(xué)顯微鏡的分辨率存在極限[1]，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率在橫向（垂直于光傳播方向）上可達(dá)到250 nm，軸向（平行于光傳播方向）可達(dá)到550 nm[2]，而許多亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)小于此分辨率尺度，因此，研究細(xì)胞器、膜蛋白等結(jié)構(gòu)還需要分辨率更高的顯微鏡。

熒光是分子在特定波長下吸收光（激發(fā)光）并發(fā)射出較長波長光（發(fā)射光），基于此可成像。超分辨熒光顯微鏡是通過改變分子的激發(fā)光或發(fā)射光，進(jìn)而突破光學(xué)衍射極限的光學(xué)成像技術(shù)的總稱。超分辨熒光顯微成像技術(shù)在納米級別的微小結(jié)構(gòu)以及生物大分子檢測等研究中發(fā)揮了重要的作用[3]。目前，超分辨熒光成像技術(shù)主要分為兩類： 一類是基于模式照明的超分辨熒光顯微鏡，包括受激發(fā)射損耗顯微鏡（Stimulated emission depletion，STED）[4，5]、結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（Structured illumination microscopy，SIM）[6，7]和可逆飽和光學(xué)線性熒光躍遷顯微鏡（Reversible saturable optical fluorescence transitions，RESOLFT）[8]; 另一類是基于單分子定位的超分辨熒光顯微鏡，包括隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡（Stochastic optical reconstruction microscopy，STORM）[9]和光激活定位顯微鏡（Photoactivated localization microscopy，PALM）[10]。

基于模式照明的超分辨熒光顯微鏡主要原理（以STED為例）為： 處于激發(fā)態(tài)的熒光分子既可通過自發(fā)熒光輻射過程以熒光的形式釋放能量回到基態(tài)，也可通過受激熒光輻射過程產(chǎn)生與外界輻射的頻率、位相、偏振相同的輻射但不發(fā)出熒光。STED利用以上效應(yīng)疊加， 使周邊區(qū)域的熒光分子淬滅，只有中心熒光分子發(fā)光，從而突破衍射極限[4，11]。目前，對于生物樣品，使用有機(jī)染料時(shí)，STED分辨率可達(dá)20 nm; 使用熒光蛋白染料時(shí)，分辨率也可達(dá)到50～70 nm[2]。

基于單分子定位的超分辨熒光顯微鏡利用單分子熒光成像的定位精度進(jìn)行超分辨成像。通過對距離較近的熒光分子分別激發(fā)，使得單個(gè)熒光分子的光斑互不影響，實(shí)現(xiàn)對單個(gè)分子的精確定位，并將多次成像的結(jié)果進(jìn)行重構(gòu)， 從而得到超分辨圖像[12]。

由于超分辨熒光顯微技術(shù)具有非侵入性、動(dòng)態(tài)表征以及分辨率高的優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于生命體內(nèi)生化反應(yīng)、調(diào)控機(jī)制、生物大分子結(jié)構(gòu)等研究[3]。但隨著研究的進(jìn)一步深入，這些超分辨熒光顯微技術(shù)仍存在一定的局限性，例如多次成像擬合會使時(shí)間分辨率受到限制，細(xì)胞內(nèi)生物大分子分布密集而無法對特定物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記染色。2015年，Chen等[13]提出了延展顯微鏡（Expansion microscopy，ExM），可有效提高時(shí)間分辨率和空間分辨率。ExM是依托凝膠吸水膨脹將生物樣品中衍射極限內(nèi)的熒光分子距離增大的一種新型超分辨熒光顯微技術(shù)，其分辨率至少可達(dá)到70 nm。

2?延展顯微鏡技術(shù)成像原理及優(yōu)勢

ExM是利用特定熒光標(biāo)記方法將用于表征生物信息的熒光信號共價(jià)連接到可吸水膨脹的凝膠上，之后凝膠擴(kuò)展時(shí)，光學(xué)衍射極限內(nèi)的熒光分子彼此遠(yuǎn)離的超分辨成像顯微技術(shù)。其原理如圖1[13]所示。使用特制的標(biāo)記物將表征生物信息位置的熒光分子與凝膠共價(jià)連接，當(dāng)凝膠遇水?dāng)U展時(shí)，熒光分子的距離也隨之變大，之后再利用激光共聚焦顯微鏡等光學(xué)顯微鏡觀察擴(kuò)展后的生物樣品。與之前的超分辨成像方法相比，由于不涉及多次采集重構(gòu)等過程，可顯著提高時(shí)間分辨率。此外，擴(kuò)展后的生物樣品其生物分子的密度顯著降低，對于復(fù)雜的密集生物結(jié)構(gòu)，延展顯微鏡可更清晰地成像。ExM操作包括標(biāo)記、凝膠化、消化、擴(kuò)展以及固定成像等步驟。

2.1?標(biāo)記

傳統(tǒng)抗體染色和基因編碼的熒光蛋白經(jīng)過延展顯微鏡中凝膠、消化步驟后，熒光消失，無法成像。因此，ExM使用的標(biāo)記物除常規(guī)抗體之外，還需要特定的物質(zhì)使熒光分子與凝膠相連。最初，ExM使用偶聯(lián)核苷酸鏈的抗體和三功能團(tuán)標(biāo)記物（圖1A）共同標(biāo)記，其中，三功能團(tuán)標(biāo)記物包括參與聚合凝膠的甲基丙烯?；⑴c抗體上偶聯(lián)核苷酸鏈可互補(bǔ)雜交的寡聚核苷酸片段以及用于顯色的熒光團(tuán)[13]。該三功能團(tuán)標(biāo)記物既可特定靶向生物分子，也可與凝膠聚合物連接。通過一抗、偶聯(lián)寡核苷酸鏈的二抗以及三功能團(tuán)標(biāo)記物先后特異性識別生物樣品后（圖1B和1C）[13]，樣品生物信息“轉(zhuǎn)移”到凝膠上，凝膠上的熒光信號即可表征生物信息。同時(shí)使用不同標(biāo)記物可對生物樣品進(jìn)行多色成像，觀測多種物質(zhì)的分布。

除了上述標(biāo)記方法外，目前，6-丙烯酰氨基己酸琥珀酰亞胺酯（AcX）[14]、甲基丙烯酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（MA-NHS）[15]等化學(xué)物質(zhì)也被用于延展顯微成像。這些物質(zhì)既可與氨基反應(yīng)，同時(shí)也可參與凝膠。生物樣品經(jīng)抗體標(biāo)記后，使用上述化學(xué)物質(zhì)處理可實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)的免疫染色與延展顯微鏡兼容。

2.2?凝膠化

ExM使用的凝膠（圖1D）多是丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺、丙烯酸鈉三者在引發(fā)劑過硫酸銨和加速劑四甲基乙二胺的作用下， 通過自由基聚合而成的三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[13]。過硫酸銨在水溶液中能產(chǎn)生SO24，使丙烯酰胺單體的雙鍵打開，活化形成自由基之后，與丙烯酸鈉和N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺聚合形成凝膠。四甲基乙二胺的游離堿基可促進(jìn)過硫酸銨形成SO24。不同濃度的N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺會影響凝膠擴(kuò)展倍數(shù)[16]，濃度越大， 擴(kuò)展倍數(shù)越小; 但濃度過小時(shí)，凝膠易斷裂，影響實(shí)驗(yàn)操作[17，18]。當(dāng)N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺的濃度為0.15%（w/w）時(shí)，凝膠在去離子水中可達(dá)到45倍的線性擴(kuò)展，且不影響實(shí)驗(yàn)操作[13]。此外，Truckenbrodt等[19， 20]提出的×10 ExM利用N，N-二甲基丙烯酰胺（DMAA）和丙烯酸鈉作為單體，經(jīng)過硫酸鉀和四甲基乙二胺催化形成聚合物凝膠[21]，其在水中可達(dá)到10倍的線性擴(kuò)展。

2.3?消化

經(jīng)凝膠擴(kuò)展后的生物樣品能否正確反映生物信息的相對位置是ExM的關(guān)鍵。為保證生物樣品各向同性擴(kuò)展， ExM需使用非特異蛋白酶消化處理水凝膠和生物樣品形成的復(fù)合物，使其在擴(kuò)展過程中各方向作用力相近，避免生物樣品相對位置的變化以及“偽影”的產(chǎn)生。Tillberg等[14]的研究表明，相比于賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶（LysC）和高壓滅菌鍋處理，蛋白酶K消化能夠更好地表現(xiàn)樣品原始的生物信息。由于內(nèi)源性生物信息已被破壞，樣品中待測分子的空間關(guān)系保持不變，定量檢測誤差約為1%～4%。

2.4?擴(kuò)展

經(jīng)消化后的生物樣品凝膠復(fù)合物在水溶液中吸水脹大，即擴(kuò)展過程。該步驟可使衍射極限距離內(nèi)的熒光分子之間的距離增大，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)超分辨成像。凝膠的擴(kuò)展倍數(shù)除了與凝膠單體溶液濃度相關(guān)外，還與擴(kuò)展溶液存在一定的關(guān)系。由于凝膠內(nèi)外的滲透壓差，消化后的凝膠在去離子水中可達(dá)到最大的擴(kuò)展倍數(shù)[22]。更換3～5次水，可使凝膠的膨脹體積穩(wěn)定，可增加100倍。擴(kuò)展后的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)如圖1E所示，經(jīng)擴(kuò)展后的樣品成分99%是水[14]，顏色透明，方便成像。

2.5?固定和成像

成像過程中，若將擴(kuò)展后的凝膠置于普通玻片上會發(fā)生漂移的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響成像。為了減少成像過程中凝膠的漂移，特別是長時(shí)間成像的實(shí)驗(yàn)，需要將擴(kuò)展后的凝膠固定于玻片上。目前，常用的固定方法有聚賴氨酸修飾玻片、瓊脂糖包埋及強(qiáng)力膠粘合。利用聚賴氨酸和凝膠之間相反電荷的吸附作用，可使擴(kuò)展樣品附著于玻片上。與之相比，瓊脂糖和強(qiáng)力膠固定可形成不透明界面，進(jìn)而引入光學(xué)散射，因此不能應(yīng)用于倒置光學(xué)顯微鏡，但其附著力較強(qiáng)，可使樣品在數(shù)天內(nèi)穩(wěn)定成像[23]。

擴(kuò)展后的生物樣品通過顯微鏡進(jìn)行成像，目前使用較多的是寬場熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡，經(jīng)過4.5倍線性擴(kuò)展，ExM分辨率可達(dá)到60～70 nm[24]。

3?延展顯微鏡的發(fā)展

自Chen等[13]于2015年提出ExM概念以來，目前主要有3種不同的ExM[24]： 蛋白保留延展顯微鏡（Protein retention ExM， ProExM）用于細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)信號蛋白的分布研究，使用免疫染色，凝膠體積膨脹可達(dá)100倍（各方向擴(kuò)展4.5倍）[14，15]; 原位雜交延展顯微鏡（Expansion fluorescent in situ hybridization，ExFISH）用于RNA結(jié)構(gòu)以及納米級RNA位置的研究，由于雜交緩沖液的限制，其可引起各方向3倍的膨脹[25，26]; 迭代延展顯微鏡（Iterative ExM，iExM）通過對樣本進(jìn)行兩次擴(kuò)展，以獲得更高分辨率，體積膨脹可達(dá)10000倍，分辨率可達(dá)到25 nm[27]。

3.1?ProExM

ProExM通過化學(xué)試劑AcX等將標(biāo)記生物樣品的抗體、鏈霉親和素或者熒光蛋白等與凝膠連接，致使抗體上的熒光信號在凝膠擴(kuò)展之后仍可保留50%以上，從而實(shí)現(xiàn)免疫染色與ExM兼容。

針對不同的染色要求，根據(jù)AcX處理的順序?qū)roExM可分為三類[14]： （1）生物樣品經(jīng)固定、免疫染色后，使用AcX處理，再進(jìn)行凝膠化、消化、擴(kuò)展成像等步驟，主要用于免疫染色的細(xì)胞和組織成像; （2）生物樣品表達(dá)熒光蛋白后固定，使用AcX處理，之后進(jìn)行凝膠化等步驟，主要用于轉(zhuǎn)染熒光蛋白的生物樣品; （3）生物樣品經(jīng)固定后，使用AcX處理，經(jīng)過凝膠化、溫和的勻漿程序（如堿性水解變形或LysC消化）和擴(kuò)展之后進(jìn)行免疫染色，主要適用于擴(kuò)展前排列緊密的組織或生物大分子。

除AcX外，Chozinski等[15]使用MA-NHS或GA對免疫標(biāo)記的生物樣品進(jìn)行處理，使免疫染色可用于ExM。MA-NHS既具有連接蛋白質(zhì)的基團(tuán)，也有與ExM三功能標(biāo)記物相同的甲基丙烯?；A既可與細(xì)胞上的氨基作用，也可與凝膠中氨基作用。

3.2?ExFISH

細(xì)胞內(nèi)RNA的結(jié)構(gòu)等信息對于分析細(xì)胞類型和解析表達(dá)譜具有重要作用。單分子熒光原位雜交（Single-molecule fluorescence in situ hybridization，smFISH）技術(shù)是測定RNA拷貝數(shù)以及空間定位的有效方法，但目前只能在單細(xì)胞中同時(shí)檢測10～30種RNA。Moffitt等[28]提出的Multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization（MERFISH）技術(shù)，可鑒定單細(xì)胞中數(shù)千種RNA的拷貝數(shù)和空間定位，進(jìn)而分析與蛋白質(zhì)相關(guān)的RNA分布以及預(yù)測基因功能。但是，在細(xì)胞中，RNA分子之間相互重疊，致使高豐度RNA多重成像受到限制。

ExFISH是通過Label X等化學(xué)物質(zhì)將RNA共價(jià)連接到凝膠上，利用ExM中凝膠擴(kuò)展降低RNA密度，再進(jìn)行RNA單分子熒光原位雜交檢測的技術(shù)。

Label X可由Label-IT Amine 和AcX合成，既可與RNA中鳥嘌呤N7反應(yīng)，也可參與凝膠[26]。Label X共價(jià)連接凝膠的方法，在確保大多數(shù)RNA至少與凝膠有一個(gè)連接點(diǎn)的同時(shí)，會使大多數(shù)RNA中多處與凝膠共價(jià)連接，在擴(kuò)展過程中，RNA可能會被拉伸。另一種將RNA共價(jià)連接到凝膠的方法是利用Acrydite修飾的poly-dT寡核苷酸鏈，既可與mRNA的polyA尾部雜交，也可與凝膠共價(jià)連接。Wang等[25]利用該寡核苷酸鏈將MERFISH技術(shù)和延展顯微技術(shù)聯(lián)用，顯著提高可測量RNA的密度。對人骨髓瘤細(xì)胞（U-2 OS）中的高豐度RNA進(jìn)行MERFISH成像，檢測效率接近100%。ExFISH可用于觀察單個(gè)mRNA分子的位置以及其與蛋白質(zhì)的分布，這對研究神經(jīng)信號傳導(dǎo)以及基因表達(dá)調(diào)控具有重要作用。

3.3?iExM

傳統(tǒng)的ExM由于單體溶液等的限制，最多可實(shí)現(xiàn)4.5倍的線性擴(kuò)展，iExM通過兩次凝膠擴(kuò)展過程，將生物樣品進(jìn)行雙倍膨脹，可達(dá)到約20（4.5 × 4.5）倍的線性膨脹，有效分辨率約25 nm。iExM的成像原理如圖2所示[27]： 生物樣品（圖2A）第一次凝膠（圖2B）過程選用了在堿性條件下可裂解的交聯(lián)劑N，N'-（1，2-二羥基乙烯）雙丙烯酰胺（DHEBA），消化擴(kuò)展（圖2C）后，被常規(guī)交聯(lián)劑N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺形成的凝膠再次包埋（圖2D），經(jīng)堿性溶液切割之前的凝膠后，進(jìn)行二次擴(kuò)展（圖2E）。在第一次凝膠過程中，不含熒光團(tuán)但可與二抗上寡核苷酸鏈A'互補(bǔ)雜交的功能團(tuán)標(biāo)記物I參與凝膠（圖2F和2G），經(jīng)蛋白酶消化擴(kuò)展后，利用含有熒光團(tuán)的三功能標(biāo)記物Ⅱ進(jìn)行標(biāo)記（圖2H），并進(jìn)行二次凝膠（圖2I），堿性條件裂解第一次凝膠后再次擴(kuò)展（圖2J）。其中， 三功能標(biāo)記物Ⅱ中的寡核苷酸序列A'（與二抗上偶聯(lián)的寡核苷酸鏈序列相同）和功能團(tuán)標(biāo)記物I中的寡核苷酸序列A可互補(bǔ)配對，從而使生物信息可通過二次凝膠上的熒光團(tuán)加以表征。經(jīng)過兩次擴(kuò)展，原本距離較近的生物分子彼此遠(yuǎn)離。iExM成像與擴(kuò)展前STORM成像之間的誤差很小，約為測量長度的2.5%。iExM對于細(xì)胞的畸變約為9 nm，組織為13 nm。經(jīng)iExM兩次凝膠擴(kuò)展后的生物樣品可在熒光顯微鏡下解析小鼠大腦突觸結(jié)構(gòu)，分析單個(gè)突觸連接問題[27]。

4?延展顯微鏡的生物學(xué)應(yīng)用

研究生物大分子在細(xì)胞、組織中的分布可為生化反應(yīng)、細(xì)胞間信號傳導(dǎo)以及細(xì)胞功能等研究提供重要的信息，ExM作為新型超分辨手段，已被應(yīng)用于生物學(xué)研究的不同領(lǐng)域。

4.1?ExM在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用

細(xì)胞的微管對于細(xì)胞器和生物大分子的分布和功能起著重要的組織作用，通常作為光學(xué)顯微鏡分辨率判斷的依據(jù)。利用ExM可對細(xì)胞中微管清晰成像，分辨率至少可達(dá)到70 nm。

Chen等[13]對HEK 293細(xì)胞中的微管進(jìn)行成像（圖3A～3D），對圖3D中虛線（沿微管垂直）方向的熒光強(qiáng)度定量分析圖中曲線進(jìn)行高斯擬合，可得到（83.8±5.68） nm的半峰全寬，該半峰全寬可表征ExM成像的有效分辨率。此外，通過ExM也可觀察到網(wǎng)格蛋白涂層的凹坑（圖3E和3H），相比超分辨結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（Super-resolution structured illumination microscopy，SR-SIM）成像（圖3F，3G）更為清晰[13]。Tillberg等[14]根據(jù)ProExM步驟對細(xì)胞、組織等生物樣品進(jìn)行擴(kuò)展，使用共聚焦顯微鏡對擴(kuò)展后HeLa細(xì)胞的遺傳編碼具有熒光團(tuán)的融合蛋白進(jìn)行成像，微管蛋白的半峰全寬可達(dá)67 nm，表明分辨率可達(dá)到70 nm; 同時(shí)，對網(wǎng)格蛋白和角蛋白雙色成像證實(shí)該方法可用于研究多種蛋白之間的位置關(guān)系。Chozinski等[15]對擴(kuò)展后的PtK1細(xì)胞有絲分裂時(shí)期成像可觀察到動(dòng)粒纖維微管束和染色體附著于紡錘體上，對擴(kuò)展后的BS-C-1細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體成像顯示， 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與兩個(gè)線粒體緊密并置。利用激光共聚焦顯微鏡可觀察到iExM擴(kuò)展的BS-C-1細(xì)胞微管的空心結(jié)構(gòu)[23]。

4.2?ExM在神經(jīng)生物學(xué)研究中的應(yīng)用

神經(jīng)回路中的生物大分子以及細(xì)胞間連接對于生物體正常生命活動(dòng)具有至關(guān)重要的作用，研究腦組織中生物分子的分布以及突觸結(jié)構(gòu)，對于治療疾病等具有重要作用。ExM也被用于解析小鼠海馬體等神經(jīng)元之間的突觸連接，觀察神經(jīng)遞質(zhì)受體、突觸支架蛋白以及神經(jīng)遞質(zhì)合成酶等蛋白的分布[29～32]。

Chen等[13]對表達(dá)遺傳編碼熒光蛋白的擴(kuò)展后腦組織成像，發(fā)現(xiàn)突觸前膜Bassoon以及突觸后膜Homer1分布于CA1腔隙分子層樹突棘（圖4A～4D），并且經(jīng)ExM擴(kuò)展后的腦組織在共聚焦顯微鏡下成像時(shí)，二者可清楚地區(qū)分（圖4E和4F）。Tillberg等[14]利用ProExM成功揭示了小鼠、果蠅、斑馬魚腦中的突觸結(jié)構(gòu)，以及人類癲癇患者腦標(biāo)本中血管附近的星形膠質(zhì)細(xì)胞間隙連接，在對經(jīng)ProExM擴(kuò)展后的完整哺乳動(dòng)物腦組織表達(dá)的熒光蛋白成像時(shí)，可清晰觀察到樹突狀脊柱形態(tài)，以及薄的脊柱頸部。Chozinski等[15]對擴(kuò)展后的THY1-YFP-H小鼠腦組織成像，可清晰地觀察到突觸和樹突棘之間的連接。

4.3?ExM在其它領(lǐng)域中的應(yīng)用

除了用于研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能、細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用外，ExM也被用于RNA等物質(zhì)的成像。Chen等[26]對長鏈非編碼RNA進(jìn)行成像，觀測到了NEAT1 lncRNAs清晰的環(huán)形形態(tài)以及l(fā)ncRNA XIST滅活X染色體的圖像（圖5A～5E）。擴(kuò)展后的小鼠腦組織樣品，在寬視野顯微鏡下可清晰觀測到Y(jié)FP mRNA定位于YFP熒光細(xì)胞，谷氨酸脫羧酶1（Gad 1）mRNA定位于皮層和海馬的特定層中具有特征性排列的細(xì)胞群，在共聚焦顯微鏡最大放大倍數(shù)下，可觀測到單個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，達(dá)到單分子精度，在3 h內(nèi)，即可完成575 μm × 575 μm × 160 μm組織樣品的測量。Wang等[25]對U-2 OS同時(shí)利用ProExM標(biāo)記鈣粘蛋白和MERFISH標(biāo)記RNA的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，二者可兼容，不會影響彼此的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在數(shù)以萬計(jì)的RNA，延展顯微技術(shù)將RNA彼此分離，降低密度，可顯著提高單個(gè)細(xì)胞中RNA測量的種類。而MERFISH和proExM的聯(lián)用，可在單細(xì)胞中同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的測定。

5?總結(jié)與展望

目前，ExM已經(jīng)實(shí)現(xiàn)與傳統(tǒng)免疫染色兼容，通過改變凝膠單體、交聯(lián)劑的種類和濃度可達(dá)到10倍的線性擴(kuò)展，通過2次凝膠擴(kuò)展可達(dá)到20倍的線性膨脹，分辨率逐步提高。將ExM和SIM兩種超分辨技術(shù)聯(lián)用，對人類病原體賈第蟲的細(xì)胞骨架成像，證實(shí)其在超高分辨水平下的各項(xiàng)同性擴(kuò)展，兩種超分辨技術(shù)聯(lián)用可使空間分辨率達(dá)30 nm [33，34]。然而，對于其它的超分辨技術(shù)，如單分子定位顯微鏡，其與ExM聯(lián)用還存在諸多問題： 凝膠擴(kuò)展過程中使軸向厚度增加，超過了油鏡成像的高度，影響成像精度; 基于單分子定位的超分辨熒光顯微鏡特殊的成像緩沖溶液會對凝膠的擴(kuò)展產(chǎn)生影響，導(dǎo)致擴(kuò)展倍數(shù)變小; 現(xiàn)有的染色標(biāo)記方法對于擴(kuò)展后的樣品標(biāo)記密度較低[35，36]。而且，隨著分辨率提高，探針[37]的大小也將成為阻礙成像分辨率提高的主要因素。此外，ExM研究多處于技術(shù)證實(shí)階段，主要對已知形態(tài)的細(xì)胞微管蛋白以及腦組織結(jié)構(gòu)等成像[38～41]，而對于其它亞顯微生物學(xué)樣品[42]的成像研究甚少。隨著研究深入，ExM依靠其時(shí)間分辨率以及減小生物信息密度等優(yōu)勢，將被應(yīng)用于越來越多的單分子成像。

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