HBV-M定性與HBV-DNA定量聯(lián)合檢測在診治乙型肝炎中的臨床價值

(河南省南陽市第一人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科， 河南 南陽 473000)

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)所致肝臟疾病，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，若未及時處理或處理不當(dāng)，可演變?yōu)楦斡不?，?yán)重者會危及患者生命[1]。本病的診斷主要依賴于HBV感染5項血清免疫標(biāo)志物，可直觀反映患者免疫應(yīng)答狀態(tài)，但其無法直接反映HBV在人體內(nèi)復(fù)制情況[2]。新近研究表明，HBV感染后，外周血中乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)的檢出能反映完整的HBV顆粒釋放，是反映病毒復(fù)制最直接、可靠指標(biāo)[3]?，F(xiàn)階段，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)在基因診斷中凸顯巨大優(yōu)勢，其能高效檢出HBV感染和復(fù)制情況，為臨床診治工作提供參考信息[4]。本研究選取我院900例乙型肝炎患者進行研究，旨在探究乙型肝炎病毒-標(biāo)志物(HBV-M)不同模式下FQ-PCR技術(shù)在HBV-DNA定量檢測中的診斷價值，詳情如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月—2018年9月我院收治的900例乙型肝炎患者作為研究對象。其中男567例，女333例；年齡18～68歲，平均(43.01±11.97)歲；病程1～5年，平均(3.01±0.84)年；臨床癥狀體征：412例上腹部不適，304例肝區(qū)痛，522例食欲減退，489例乏力。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 選取和排除標(biāo)準(zhǔn) ①納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(2015年版)》[5]診斷為乙型肝炎患者；Knodell肝組織活動指數(shù)(HAI)≥4；丙氨酸基轉(zhuǎn)移酶(ALT)≥2×ULN(ULN=40 U/L) ；近期未接受抗病毒治療者；患者與家屬知曉并簽署同意書。②排除標(biāo)準(zhǔn)：心、腎等臟器功能障礙者；甲、丙、丁、戊型肝炎者；精神疾病者；妊娠或哺乳期婦女者；酗酒和吸毒史者；以往1個月內(nèi)接受抗病毒治療者；依從性差，無法配合研究者。

1.3 檢測方法 ①標(biāo)本采集。所有患者均于清晨采集6 ml空腹肘靜脈血，分為2份，各3 ml，室溫下放置30 min，3000 r/min，離心10 min，保存于-20℃冰箱內(nèi)待測。②HBV-M模式定性檢測。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對血液標(biāo)本進行HBV-M模式定性檢測，檢測順序為HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，結(jié)合上海熱電MK 3型酶標(biāo)儀評估結(jié)果，試劑盒購自上海撫生實業(yè)有限公司，完全參照試劑盒說明書操作。③HBV-DNA定量檢測。選用中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心生物工程公司生產(chǎn)的DA 7600 PCI儀，取200 μl樣品，滴加DNA提取液Ⅰ450 ml、內(nèi)標(biāo)溶液4 μl，振蕩混勻，15 s后瞬時離心數(shù)秒，100℃恒溫處理(10±1) min，12 000 r/m離心5 min，備用，并做臨界陽性、陰性、強陽性質(zhì)控品。取2 μl上清液放入FQ-PCR反應(yīng)管進行擴增，擴增條件：94℃ 2 min，隨后94℃變性10 s，60℃退火，延伸30 s，共40個循環(huán)，上述操作完成后，電腦自動計算分析HBV-DNA定量結(jié)果，每次試驗設(shè)置4個HBV-DNA標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度，>1.00×103拷貝/毫升即為陽性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 HBV-M定性檢測結(jié)果 900例乙型肝炎患者的血液標(biāo)本中，HBV-M模式定性檢測含8種模式，271例HBsAg+HBeAg+HBcAb，347例HBsAg+HBeAb+HBcAb，130例HBsAg+HBeAb，26例HBsAg+HBeAg，34例HBsAb+HBeAb+HBcAb，18例HBsAb+HBeAb，27例HBeAb+HBcAb，47例HBcAb。

2.2 HBV-DNA定量檢測結(jié)果 900例乙型肝炎患者的血液標(biāo)本，HBV-DNA檢測陽性率為55.00%(495/900) 。

2.3 不同HBV-M模式下HBV-DNA檢測結(jié)果 HBsAg+HBeAg+HBcAb模式下HBV-DNA陽性率高于HBsAg+HBeAb+HBcAb、HBsAg+HBeAb、HBsAb+HBeAb+HBcAb模式(χ2=265.483，P<0.001；χ2=112.295，P<0.001；χ2=238.421，P<0.001)；HBsAg+HBeAg模式陽性率明顯高于HBsAg+HBeAb+HBcAb、HBsAg+HBeAb、HBsAb+HBeAb+HBcAb模式(χ2=33.162，P<0.001；χ2=9.992，P=0.001；χ2=41.489，P<0.001)。HBsAg+HBeAg+HBcAb模式的HBV-DNA含量明顯高于HBsAg+HBeAg、HBsAg+HBeAb+HBcAb、HBsAg+HBeAb、HBsAb+HBeAb+HBcAb模式(t=63.823，P<0.001；t=452.939，P<0.001；t=369.598，P<0.001；t=217.838，P<0.001)。見表1。

表1 比較不同HBV-M模式下HBV-DNA檢測結(jié)果

注：與HBsAg+HBeAg+HBcAb模式HBV-DNA陽性率比較，a：P<0.05，b：P<0.001；與HBsAg+HBeAg模式HBV-DNA陽性率比較，c：P<0.001，d：P<0.01；與HBsAg+HBeAg+HBcAb模式HBV-DNA含量比較，e：P<0.0001

3 討論

HBV感染具有發(fā)病率高、傳染力強等特征，感染HBV后，部分乙型感染患者會演變?yōu)槁愿窝?，甚至繼發(fā)肝炎、肝癌等疾病，現(xiàn)已成為全球嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題之一[6-7]。由此可見，早期診斷HBV感染并給予治療，在延緩病情進展、改善預(yù)后等方面意義重大。

目前，本病檢測方法多種多樣，如ELISA法、FQ-PCR技術(shù)定量檢測、放射免疫法等，其中ELISA法僅能反映HBV病毒免疫應(yīng)答狀態(tài)，對機體HBV感染復(fù)制及傳染危險性反映不準(zhǔn)確，F(xiàn)Q-PCR作為HBV-DNA最直接參考指標(biāo)，能動態(tài)、直接反應(yīng)HBV病毒復(fù)制狀態(tài)及危險性，但HBV-DNA定量受核苷類藥物及實驗條件影響較大，無法真實反映肝細(xì)胞內(nèi)HBcAg定量[8-10]。高娟等[11]學(xué)者主張將FQ-PCR、ELISA法聯(lián)合用于乙型肝炎患者，其研究結(jié)果顯示，大三陽(HBsAg+HBeAg+HBcAb)組HBV-DNA陽性率及表達(dá)水平最高，分別為94.60%、(6.57±1.51)lg拷貝/毫升。本研究數(shù)據(jù)顯示，HBsAg+HBeAg+HBcAb模式陽性為98.89%，HBsAg+HBeAg模式陽性率為92.31%，HBV-DNA含量為[(5.57×106)±(2.37×105)]lg拷貝/毫升，明顯高于其他模式，與上述研究具有相似性，該結(jié)果說明HBsAg、HBeAg同時為陽性時，患者體內(nèi)HBV-DNA復(fù)制活躍，且病毒傳染性增加。分析原因在于HBeAg陽性、HBV-DNA升高是反映HBV復(fù)制最敏感指標(biāo)，一旦血清中HBeAg呈陽性表達(dá)時，病毒復(fù)制活躍，血中HBV-DNA升高，且多伴有不同程度肝臟壞死、炎癥、轉(zhuǎn)氨酶升高現(xiàn)象[12-13]。同時本研究中HBsAg+HBeAb+HBcAb模式HBV-DNA陽性率為35.16%，HBV-DNA含量為[(4.14×105)±(1.54×104)]lg拷貝/毫升，低于HBsAg+HBeAg+HBcAb模式，與陳海雁等[14]研究結(jié)果具有一致性，提示乙型肝炎患者體內(nèi)HBeAg已轉(zhuǎn)陰，但病毒復(fù)制尚未停止，仍存在傳染性，需采取相對應(yīng)預(yù)防措施。同時HBsAb+HBeAb、HBeAb+HBcAb模式HBV-DNA陽性率為0%，提示HBeAg、HBsAg已轉(zhuǎn)陰，HBs的產(chǎn)生提示患者體內(nèi)HBV病毒已完全清除[15]。

綜上可知，不同HBV-M模式的HBV-DNA陽性率及表達(dá)水平存在差異，故聯(lián)合HBV-M定性與HBV-DNA定量檢測對乙型肝炎臨床診治意義重大，值得臨床推廣及應(yīng)用。