速生薄口螨休眠體的形態(tài)和分子特征鑒定

許薇，朱志偉2，孫恩濤2，趙金紅

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 214002；2. 皖南醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，安徽 蕪湖 214002)

速生薄口螨(Histiostoma feroniarum)隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)、蛛形綱(Arachnida)、蜱螨亞綱(Acari)、真螨總目(Acariformes)、疥螨目(Sarcoptiformes)、無氣門股(Astigmata)、薄口螨科(Histiostomidae)、薄口螨屬(Histiostoma)。速生薄口螨主要營腐生生活，喜潮濕腐爛的隱蔽環(huán)境，常在潮濕腐敗的食物或液體、半液體上生活。它一方面取食菌絲、子食體，蛀蝕栽培料，另一方面又可以攜帶并傳播病原雜菌，對(duì)食用菌生產(chǎn)產(chǎn)生雙重威脅[1]。此外，速生薄口螨還可引起人體螨病，危害人體健康[2]。目前薄口螨科報(bào)道的主要有速生薄口螨(Histiostoma feroniarum)、吸腐薄口螨(Histiostoma sapromyzarum)、實(shí)驗(yàn)室薄口螨(Histiostoma laboratorium)和美麗薄口螨(Histiostoma pulchrum)四種，他們的形態(tài)尤其是其休眠體的形態(tài)非常相似，難以鑒別。分子鑒定是鑒別螨類的一種比較簡單并準(zhǔn)確的方法。目前對(duì)速生薄口螨的研究中，大多建立在光鏡下形態(tài)特征和生活環(huán)境觀察上，較少涉及到分子特征的鑒定，目前也尚未見報(bào)道速生薄口螨的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)片段。本研究首先在光鏡和掃描電鏡下觀察速生薄口螨休眠體的外部形態(tài)特征，然后對(duì)速生薄口螨休眠體的細(xì)胞色素氧化酶亞基 1(cytochrome oxidase 1，cox1)和ITS基因進(jìn)行擴(kuò)增和序列分析，為其休眠體的鑒定和生物學(xué)分類提供依據(jù)，為進(jìn)一步開展速生薄口螨的種群遺傳學(xué)研究、物種間親緣關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化及害蟲防治等提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究所采集樣本為實(shí)驗(yàn)室中儲(chǔ)存時(shí)間≥1年的生姜。主要儀器和試劑：光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS，BX-1型)、掃描電子顯微鏡(日本JEOL，JSM-6490LA型)、解剖鏡(中國MOTIC，ST-39型)、永久封固劑(蒸餾水50 ml，10%水合氯醛5 ml，甘油20 ml，阿拉伯膠30 g)、乙醚、無水乙醇、戊二醛、Taq PCR Master Mix、Proteinase K、DNA Polymerase和DNA marker DL2000，購于上海生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本制作 光鏡下，用零號(hào)毛筆從生姜樣品中挑出螨休眠體，震蕩洗滌，整理姿勢(shì)，封片固定并拍照[3]，根據(jù)Hughes(1976)[4]方法進(jìn)行蟲種鑒定、分類。同時(shí)挑取部分速生薄口螨休眠體，蒸餾水反復(fù)多次振蕩清洗后，保存在75%乙醇溶液中用于基因組DNA提取。

1.2.2 電鏡樣本制備 取2.5%戊二醛固定速生薄口螨休眠體數(shù)只，再用5%醋酸戊酯置換，然后用潔凈毛發(fā)針整姿并將其固定在覆蓋導(dǎo)電雙面膠的電鏡樣品托上，臨界點(diǎn)干燥后在電鏡下(5～10 kV加速電壓)進(jìn)行掃描觀察，選擇清晰圖像并拍照。

1.2.3 DNA提取、引物設(shè)計(jì)和PCR克隆擴(kuò)增 從單頭螨體中提取總DNA，方法參照溫碩洋等[5]，并稍加改動(dòng)。根據(jù)GenBank中粉螨亞目的屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus，NC_012218.1)、伯氏嗜木螨(Caloglyphus berlesei，NC_024637.1)、橢圓食粉螨(Aleuroglyphus ovatus，NC_023778.1)、長食酪螨(Tyrophagus longior，NC_028725.1)、腐食酪螨(Tyrophagus putrescentia，NC_026079.1)的cox1序列，利用DNAMAN進(jìn)行比較分析，在保守區(qū)設(shè)計(jì)cox1兼并引物，序列如下：

COIF：5’-TTGCDGGKGTWTCTTCTAT-3’，

COIR：5’-ACAGCAATRATAGTAGCAG-3’。

ITS擴(kuò)增引物序列如下[6]：

ITSF：5’-TGCTTGGGATTGGGGATTGT-3’，

ITSR：5’-GCACTAATACACTAACGCCG-3’。

引物由通用生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)總體積為25 μl，含2.5 μl 10×Buffer、2.0 μl MgCl2(2.5 μmol/L)、1.5 μl dNTPs (2.5 mM/L aech)、上下游引物(5 μmol/L)各1 μl、100 ng模板基因組DNA和1 U Taq DNA聚合酶(5 U/μl)，加無菌水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)參數(shù)是：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，46℃～49℃退火30 s，72℃延伸60 s，34個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳和DNA 膠回收試劑盒純化后，連接到載體pMD19-T上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(DH5α 感受態(tài)細(xì)胞)中，通過藍(lán)白斑篩選，將陽性克隆委托上海生工生物技術(shù)有限公司采用DNA 測(cè)序儀(ABI-3730)進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.4 測(cè)序與序列分析 目的條帶測(cè)序工作由通用生物技術(shù)有限公司完成。測(cè)定序列經(jīng)過DNAMAN軟件拼接，所得序列用DNAStar軟件中的EditSeq編輯，分析其堿基組成。

2 結(jié)果

2.1 速生薄口螨休眠體光鏡形態(tài) 速生薄口螨休眠體呈扁平狀，向后緣逐漸變尖，表皮骨化較明顯，前足體呈明顯的三角狀，足Ⅲ表皮內(nèi)突相連形成一條拱形線，胸板和腹板被這條拱形線分開(圖1A)。軀體腹面末端有十分發(fā)達(dá)的吸盤板，其上有八個(gè)吸盤，吸盤呈現(xiàn)2-4-2排列。各個(gè)足體較長，后兩足向外伸展(圖1B)。

圖1 速生薄口螨休眠體光鏡特征結(jié)構(gòu) (×1000)

2.2 速生薄口螨休眠體電鏡形態(tài) 速生薄口螨電鏡下軀體長約230 μm，足四對(duì)(圖2A、圖2B)，前足體呈三角形，向前由寬而圓變?yōu)檎?，足爪上有剛毛附?圖2C、圖2D、圖2E、圖2F)，軀體表面骨化明顯，軀體背面剛毛均為短桿狀，剛毛末端無分叉，肛后毛較短(圖2A、圖2B)，軀體腹面生殖區(qū)未發(fā)育完全，可隱約看到生殖感覺器(圖2B、圖2I)，足Ⅲ、Ⅳ短而粗(圖2H)，軀體末端可見到明顯的吸盤板，吸盤板上共有四對(duì)成對(duì)的吸盤，呈2-4-2分布，吸盤表面較為光滑(圖2G)。

圖2 速生薄口螨休眠體的電鏡結(jié)構(gòu)特征

注：A.休眠體背面觀；B.休眠體腹面觀；C.休眠體前足體背面觀；D.休眠體前足體背面觀；E.休眠體前足體腹面觀；F.休眠體前足體側(cè)面觀；G.休眠體腹部吸盤板；H.休眠體后足體；I.休眠體生殖區(qū)

2.3 速生薄口螨cox1擴(kuò)增結(jié)果 速生薄口螨基因組DNA提取后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到速生薄口螨清晰的cox1基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物圖，克隆擴(kuò)增去掉引物后，基因片段大小為487 bp，利用DNAStar軟件包的Editseq軟件進(jìn)行分析得出堿基序列A、G、T、C含量分別為21.15%、19.71%、43.74%、15.40%，G+C含量為35.11%，A+T含量為64.89%。與其他幾種粉螨亞目中粉螨堿基組成方式較為接近，見表1。所測(cè)的速生薄口螨cox1片段用BLAST與Genbank中的線粒體DNA序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)速生薄口螨與其它粉螨亞目中粉螨的cox1有很高的同源性，其中與腐食酪螨(NC_026079.1)同源性為82.34%，與伯氏嗜木螨(NC_024637.1)同源性為81.31%，與屋塵螨(NC_012218.1)同源性為77.82%，與橢圓食粉螨(NC_023778.1)同源性為79.26%，與長食酪螨(NC_028725.1)同源性為80.90%。

2.4 速生薄口螨ITS擴(kuò)增結(jié)果 PCR擴(kuò)增得到速生薄口螨清晰的ITS基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物圖，克隆擴(kuò)增去掉引物后，全序列長度為1667 bp(MK250038)。利用DNAStar軟件包的Editseq 軟件進(jìn)行分析得出堿基序列A、G、T、C 含量分別為28.97%、21.36%、27.53%、22.14%，G+C含量為43.49%，A+T含量為56.51%。在GenBank中粉螨亞目有兩種已明確報(bào)道的粉螨ITS全序列，分別為刺足根螨(Rhizoglyphus echinopus)和羅賓根螨(Rhizoglyphus robini)，將所獲得速生薄口螨 ITS序列片段與其比較堿基組成，發(fā)現(xiàn)速生薄口螨(MK250038)與刺足根螨(DQ372567.1)同源性為34.30%，與羅賓根螨(DQ372568.1)同源性為36.10%，其堿基組成方式也十分接近。見表2。

表1 速生薄口螨與粉螨亞目螨類的cox1序列堿基組成

表2 速生薄口螨與粉螨亞目螨類的ITS序列堿基組成

3 討論

速生薄口螨是倉儲(chǔ)類害螨的一種，其生長期包括卵、幼螨、若螨、成螨[7]，第一與第三若螨期之間有一個(gè)休眠體期。速生薄口螨的休眠體可以孳生在食用菌栽培料中，也可以附著在各種節(jié)肢動(dòng)物身上，借此轉(zhuǎn)移到適合生長的場(chǎng)所[8]，休眠體是該螨生活史中的重要階段，是借助攜帶傳播者進(jìn)行傳播的特殊形式。段彬彬等[9]在食用菌中發(fā)現(xiàn)了該螨的休眠體，并進(jìn)行光鏡下的形態(tài)觀察。洪勇等[10]在儲(chǔ)藏洋蔥中發(fā)現(xiàn)速生薄口螨并對(duì)其形態(tài)進(jìn)行觀察。柴強(qiáng)等[11]在中藥材生姜中發(fā)現(xiàn)了孳生的速生薄口螨并對(duì)其形態(tài)進(jìn)行觀察。通過光鏡進(jìn)行觀察是對(duì)速生薄口螨休眠體最簡單直接的觀察方法，可以清楚了解速生薄口螨休眠體的外部形態(tài)特征，但是由于設(shè)備的精準(zhǔn)度有限，標(biāo)本的超微結(jié)構(gòu)不容易被觀察，借助SEM掃描電鏡則可以觀察物種的細(xì)微結(jié)構(gòu)，可明顯觀察螨類的表皮、剛毛、吸盤、生殖區(qū)的結(jié)構(gòu)特征。故本研究結(jié)合掃描電鏡和光鏡的觀察，系統(tǒng)描述了該粉螨休眠體的形態(tài)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)速生薄口螨休眠體的光鏡形態(tài)特征與之前的研究相同，而電鏡形態(tài)特征主要包括：①剛毛：背面剛毛均為短桿狀末端無分叉、肛毛較短；②外生殖器：生殖器官未發(fā)育完全，未見明顯的生殖毛；③足：足4對(duì)，足上有剛毛附著，前足體呈三角狀，后足體短而粗；④吸盤：軀體末端有三排成對(duì)的8個(gè)吸盤，吸盤板較光滑。本研究通過光鏡和掃描電鏡結(jié)合觀察到的速生薄口螨這些形態(tài)特征，豐富了該螨的形態(tài)鑒定、分類等科學(xué)資料，為速生薄口螨控制和螨病防治提供了有效的參考。

在遺傳進(jìn)化研究中，cox1是常用的分子標(biāo)記，在動(dòng)物分子鑒定以及系統(tǒng)重建過程中具有重要的意義。鄧潔等[12]利用線粒體cox1 基因?qū)τ《刃虑鷧栻?Neocypholaelaps indica Evans)進(jìn)行分子鑒定，并做系統(tǒng)發(fā)育樹和遺傳距離分析，發(fā)現(xiàn)基于cox1基因的印度新曲厲螨種內(nèi)遺傳距離和同屬新曲螨屬(Neocypholaelaps apicola)的種間遺傳距離不存在重疊區(qū)域，并且種內(nèi)和種間的遺傳距離差異顯著，說明cox1序列可以用于印度新曲厲螨的分子鑒定。吳太葆等[13]對(duì)橢圓食粉螨線粒體DNAcox1基因片段進(jìn)行測(cè)定，并與其他幾種粉螨的cox1進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)cox1含較高的AT含量是粉螨共同的現(xiàn)象?？桌镂14]利用443bp的線粒體DNAcox1片段對(duì)中國6個(gè)地理種群的柑橘全爪螨共305個(gè)個(gè)體進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性研究。本研究成功獲得了速生薄口螨的cox1基因序列。根據(jù)來自GenBank 的數(shù)據(jù)，比較速生薄口螨和粉螨亞目中其它幾種粉螨的cox1堿基組成，所得速生薄口螨cox1片段的堿基組成中，A+T的百分含量占 64.89%，與粉螨亞目其它幾種粉螨的堿基組成方式十分接近，說明粉螨亞目螨類的cox1片段中AT含量普遍較高，與粉螨亞目幾種粉螨的cox1序列同源性為77.82%～82.34%。

ITS是對(duì)粉螨進(jìn)行發(fā)育研究常應(yīng)用的核基因。真核生物基因組中編碼核糖體的基因包括28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA 4 種，它們?cè)谌旧w上頭尾相連、串聯(lián)排列，相互之間由間隔區(qū)分隔。其中18S、5.8S和28Sr DNA基因組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，三者高度保守，適合于較高等級(jí)水平的生物群體間的系統(tǒng)分析，其間的間隔區(qū)為ITS。Ben等[15]利用rDNA-ITS2片段將以色列的16種葉螨成功地區(qū)分開來。鄒志文等[16]對(duì)幾種鈍綏螨進(jìn)行ITS基因片段的序列分析，對(duì)其親緣關(guān)系進(jìn)行分析，對(duì)研究其系統(tǒng)發(fā)育和完善分類有重要意義。本研究成功獲得速生薄口螨的ITS基因序列，并且比較了速生薄口螨和粉螨亞目中其它兩種粉螨的ITS堿基組成，所得速生薄口螨ITS片段的堿基組成中，A+T 的含量占56.51%，與表中所列出的兩種粉螨的堿基組成一樣AT含量較高。而相較于粉螨亞目cox1序列較大的同源性，不同種間粉螨在ITS序列水平上雖然有一定的相似性，但也有一定程度的差異，同科的粉螨如刺足根螨和羅賓根螨則在ITS序列水平上相似性很高，說明相較cox1基因片段而言，ITS作為分子標(biāo)記差距較大，適合作為種間鑒定的工具。

本文測(cè)定了速生薄口螨核基因ITS、線粒體基因cox1片段序列，可以作為速生薄口螨系統(tǒng)發(fā)育研究的分子標(biāo)記，更準(zhǔn)確地探討速生薄口螨及其與其它粉螨種間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系 。本文結(jié)合光鏡和電鏡對(duì)速生薄口螨休眠體的形態(tài)進(jìn)行細(xì)微觀察，總結(jié)了速生薄口螨休眠體的形態(tài)及鑒別要點(diǎn)。電鏡拍攝的圖片真實(shí)、放大倍數(shù)高、圖像較為清晰，有利于對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，后續(xù)也可以推廣應(yīng)用于豐富其他螨類的形態(tài)學(xué)觀察。同時(shí)，本文測(cè)定了速生薄口螨休眠體核基因ITS、線粒體基因cox1片段序列，可以作為速生薄口螨系統(tǒng)發(fā)育研究的分子標(biāo)記，有利于更準(zhǔn)確地探討速生薄口螨及其與其它粉螨種間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

致謝!本研究得到安徽師范大學(xué)生命科學(xué)院電鏡室閆浩老師大力協(xié)助，在此謹(jǐn)表謝意。