遠(yuǎn)志湯對慢性腦低灌注大鼠認(rèn)知功能及海馬凋亡蛋白的影響

劉 妍 陳玉靜 陳文強(qiáng) 黃小波

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100053)

近年來研究[1-3]顯示在癡呆常見的類型中，不論是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD) 還是血管性癡呆 (vascular dementia, VD) 患者，在影像學(xué)方面都表現(xiàn)出腦組織的低灌注[1]。慢性腦低灌注在老年人中普遍存在，當(dāng)慢性腦低灌注發(fā)生后腦組織出現(xiàn)氧和葡萄糖供應(yīng)不足，進(jìn)而出現(xiàn)一系列的穩(wěn)態(tài)改變，包括氧化應(yīng)激、凋亡、自噬等，導(dǎo)致與認(rèn)知功能相關(guān)的區(qū)域發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞死亡，并逐漸表現(xiàn)出認(rèn)知功能的障礙，而海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡與認(rèn)知功能的障礙有著尤為密切的關(guān)系[2]。本課題組前期研究[3]顯示具有安神益智、開竅醒神功效的對藥遠(yuǎn)志和石菖蒲，能夠改善糖尿病認(rèn)知障礙大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，保護(hù)海馬神經(jīng)元。因此本研究選用由遠(yuǎn)志和石菖蒲組成的遠(yuǎn)志湯對慢性腦低灌注大鼠進(jìn)行干預(yù)，研究遠(yuǎn)志湯是否通過調(diào)控海馬凋亡相關(guān)蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2 相關(guān) X 蛋白抗體(Bcl-2 associated X protein, Bax)及半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3, Caspase-3)，而起到保護(hù)海馬神經(jīng)元，改善慢性腦低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康清潔級雄性SD大鼠，42只，鼠齡3個月，體質(zhì)量250～280 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)公司提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SCXK(京) 2016-0006，分籠飼養(yǎng)，維持室內(nèi)溫度18～25 ℃，濕度60%～70%，普通飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水，維持光暗12 h/12 h。

1.2 藥物及主要試劑

參照本課題組前期研究[3]結(jié)果，遠(yuǎn)志湯中遠(yuǎn)志、石菖蒲按照1∶1的比例配伍。參照《中華人民共和國藥典》(2015年版)[4]，確定生藥產(chǎn)地、炮制方法，委托首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院制劑室進(jìn)行加工，并對相對密度、pH值、衛(wèi)生學(xué)等進(jìn)行檢測。4 ℃儲存?zhèn)溆?，保存時間不超過1周，用前搖勻。鹽酸多奈哌齊由中國衛(wèi)材藥業(yè)有限公司提供。羊抗鼠抗體IgG H&L (Alexa Fluor?488)及羊抗兔抗體IgG H&L (Alexa Fluor?594)購自英國Abcam公司。免疫熒光相關(guān)試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 慢性腦低灌注模型的制備

參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎術(shù)制備慢性腦低灌注模型。大鼠術(shù)前適應(yīng)環(huán)境1周，術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。0.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的戊巴比妥鈉(0.5 mL/100 g i.p.)麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上，頸前皮膚去毛，碘伏消毒，頸前正中切開，鈍性分離皮下淺筋膜，沿氣管雙側(cè)仔細(xì)分離胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌，見動脈鞘；用玻璃分針分離暴露雙側(cè)頸總動脈并埋線，用絲線分別雙重結(jié)扎兩側(cè)頸總動脈，并于兩結(jié)扎點(diǎn)之間剪斷血管，逐層縫合切口，消毒待醒。術(shù)中白熾燈照射保持大鼠肛溫在36.5～37.5 ℃。術(shù)后單籠放置，防止窒息。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥

采用數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為：①對照組：3月齡正常大鼠；②模型組：慢性腦低灌注模型；③假手術(shù)組：分離暴露雙側(cè)頸總動脈，但不予結(jié)扎，不阻斷血流；④遠(yuǎn)志湯高劑量組；⑤遠(yuǎn)志湯中劑量組；⑥遠(yuǎn)志湯低劑量組；⑦陽性藥物對照組(鹽酸多奈哌齊)。每組6只大鼠，其中，用藥各組分別于造模術(shù)后1周開始灌胃給藥，按 10 mL/kg灌胃，1次/d，給藥4周；對照組、模型組及假手術(shù)組同時給予同等劑量0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氯化鈉注射液。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物與人體的每千克體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表，成人與大鼠的折算系數(shù)為6.25，計(jì)算大鼠灌胃中藥的劑量，遠(yuǎn)志湯高、中、低3 個劑量組，給藥劑量分別為20、10、5 g/(kg·d)，以恒溫水浴鍋分別濃縮成含生藥2.0、1.0、0.5 g/mL；鹽酸多奈哌齊0.52 mg/(kg·d)制成溶液。

1.5 Morris水迷宮測試

給藥結(jié)束后進(jìn)行Morris 水迷宮行為測試。水迷宮由圓形水池和自動攝像及電腦分析系統(tǒng)組成。水池上方的攝像機(jī)同步記錄大鼠的運(yùn)動軌跡。測試前將水注入池中，水深30 cm，水面高出站臺表面1 cm，放入奶粉使之成為乳白色，使大鼠不能見到站臺，水溫控制在22～25 ℃。實(shí)驗(yàn)前1 d，將每只大鼠頭部染黑，每只動物第1天訓(xùn)練2次使之學(xué)習(xí)并產(chǎn)生記憶，入池位置為站臺的對象限及鄰象限，于象限邊1/2弧度處將動物頭朝池壁入水，120 s未找到站臺者，將其引至站臺，放置30 s引導(dǎo)其學(xué)習(xí)與記憶，訓(xùn)練期環(huán)境保持安靜與參照物不變。

定位航行實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行5 d。數(shù)據(jù)采集及圖像分析均由圖像自動監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后記錄各動物的到達(dá)站臺的游動時間及距離、初始角度、搜索站臺的軌跡及逃避潛伏期，設(shè)定逃避潛伏期的時限為120 s。

定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將水下平臺撤除，在同一入水點(diǎn)將大鼠頭朝池壁放入水中，讓大鼠在無平臺情況下尋找記憶中的平臺進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn) ，記錄大鼠在原平臺象限的活動時間。

1.6 腦組織取材及切片制作

各組大鼠在術(shù)后5周麻醉處死，0.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))戊巴比妥鈉(10 mL/kg)腹腔注射麻醉后，沿肋弓剪開腹部皮膚、肌肉、腹膜，剪斷肋骨，剪開膈肌，小心勿刺中心臟，剪至第二肋骨，輕輕分離心臟與胸壁，用止血鉗翻開肋骨固定，再用鑷子分離心臟前筋膜，暴露主動脈弓；磨鈍針頭從心尖部刺入心臟后，進(jìn)入主動脈后夾上止血鉗。灌注0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氯化鈉注射液并同時剪開右心耳，灌注氯化鈉注射液約15 min，灌注量達(dá)200 mL，見右心耳流水變清亮、肝臟變蒼白色，隨后灌注4 ℃ 4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛(pH值為7.4)，400 mL，灌注時間30 min后，鼠前后肢、尾、頸僵硬，停止灌注?？焖贁囝^取腦，沿枕骨下剪斷鼠頭部，然后剪開頭皮、盡量分離，用剪刀剪開鼠枕骨，再用止血鉗撬開頭骨，完全暴露腦組織，用止血鉗插入顱底分離出腦組織，取出大腦置于4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛中后固定過夜，再于30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖中沉淀。24 h取出腦組織，參照大鼠圖譜，選取海馬、紋狀體、大腦皮質(zhì)和腦干等部位，滴取OCT冷凍切片包埋劑，固化后的組織從視交叉向后于恒低溫切片機(jī)-18 ℃連續(xù)冠狀切片，厚度8 μm，用賴氨酸處理好的玻片貼片，每張玻片貼3張切片。待貼好切片的玻片干燥后放于切片盒中，-20 ℃冰箱保存。

1.7 免疫熒光染色

切片在二甲苯中脫蠟，梯度乙醇水化。微波照射進(jìn)行抗原修復(fù)后，50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇[含3%(體積量分?jǐn)?shù))H2O2]抑制非特異性過氧化物酶，99%(體積分?jǐn)?shù))蟻酸處理5 min，20%(體積分?jǐn)?shù))馬血清常溫封閉40 min，分別加入適量稀釋的一抗，Bcl-2、Bax和Caspase-3(均為1∶1 000)4 ℃孵育過夜，陰性對照無一抗孵育，次日室溫孵育45 min，加入熒光標(biāo)記二抗Alexa Fluor 488-羊抗鼠抗體(Bcl-2)或Alexa Fluor 594-羊抗兔抗體(Bax和Caspase-3)(均為1∶500)，室溫孵育1 h，使用50 mg/L DAPI 10 min復(fù)染核，緩沖甘油液封片，倒置相差熒光顯微鏡下拍照采集圖像，運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0將綠色/紅色熒光單色照片轉(zhuǎn)換為黑色圖片，選取圖片中黑色作為判斷陽性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，分析每張圖片得出平均積分吸光度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 遠(yuǎn)志湯對大鼠Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)的影響

雙因素重復(fù)測量的方差分析及其兩兩比較結(jié)果顯示，模型組大鼠較對照組和假手術(shù)組逃避潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，搜索距離明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。遠(yuǎn)志湯各劑量組大鼠逃避潛伏期和搜索距離均較模型組明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中以高、中劑量組更為顯著，詳見表1、表2。

2.2 遠(yuǎn)志湯對大鼠Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)的影響

與對照組和假手術(shù)組相比，模型組大鼠在原平臺所在象限搜索時間明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。遠(yuǎn)志湯各劑量組大鼠在原平臺所在象限搜索時間均較模型組顯著延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，詳見表3。

2.3 遠(yuǎn)志湯對慢性腦低灌注大鼠海馬凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

模型組大鼠海馬Bax和Caspase-3的表達(dá)較對照組和假手術(shù)組有顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Bcl-2的表達(dá)較對照組和假手術(shù)組則顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。使用遠(yuǎn)志湯高、中劑量干預(yù)后Bax和Caspase-3的表達(dá)顯著減少(P<0.05)，而Bcl-2的表達(dá)顯著增加(P<0.05)，而遠(yuǎn)志湯低劑量干預(yù)對Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)的變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4、圖1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較Tab. 1 Comparison of escape latency of Morris water maze experiment in each group

Analysis of variance analysis for two-factor repeated measures (corrected by Greenhouse-Geisser): day:F=47.544,P=0.000; day×group:F=0.703,P=0.681; group:F=52.140,P=0.000.△P<0.05,△△P<0.01vscontrol group at the same time point;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group at the same time point.

表2 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)搜索距離比較Tab.2 Comparison of search distance of Morris water maze experiment in each group

Analysis of variance analysis for two-factor repeated measures (corrected by Greenhouse-Geisser): day:F=51.261,P=0.000; day×group:F=0.855,P=0.713; group:F=78.276,P=0.000.△△P<0.01vscontrol group at the same time point;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group at the same time point.

表3 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)原平臺象限活動時間比較Tab.3 Comparison of search time in the quadrant of the original platform in Morris water maze experiment in each group

表4 各組大鼠海馬Bcl-2、Bax和Caspase-3含量比較Tab. 4 Level of Bcl-2， Bax and Caspase-3 in hippocampus of each group

△P<0.05,△△P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.Bcl-2: B-cell lymphoma-2;Bax: Bcl-2 associated X protein;Caspase-3: cysteinyl aspartate specific proteinase-3.

圖1 Bcl-2、Bax和Caspase-3在各組大鼠海馬組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of Bcl-2, Bax and Caspase-3 in hippocampus of rats in each group

Representative photomicrographs of immunofluorescence staining with an anti-Bcl-2(A), anti-Bax(B), anti-Caspase-3(C) antibody in hippocampus of rats in each group.1: control group;2: model group;3: sham operation group;4: Yuanzhi decoction high dose group;5: Yuanzhi decoction medium dose group;6: Yuanzhi decoction low dose group;7: donepezil hydrochloride group；Bcl-2: B-cell lymphoma-2;Bax: Bcl-2 associated X protein;Caspase-3: cysteinyl aspartate specific proteinase-3.

3 討論

腦缺血尤其是老年人普遍存在的慢性腦低灌注與認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展有著極為密切的聯(lián)系[6]。中醫(yī)理論認(rèn)為，老年人年老體衰，腎精不足，臟腑得不到正常濡養(yǎng)，以致氣血津液運(yùn)行不暢，聚而生痰，痰濁日久，腦失所養(yǎng)，蒙蔽清竅，阻痹神明，表現(xiàn)為神情癡呆，語無倫次，遇事多忘等癥。如《石室秘錄·呆病》[7]云：“痰氣最盛，呆氣最深”，指出痰濁是本病的重要病機(jī)。本課題組從痰濁蒙蔽清竅入手，選用具有安神益智、開竅醒神功效的臨床常用對藥遠(yuǎn)志和石菖蒲，二者配伍應(yīng)用，名曰遠(yuǎn)志湯。遠(yuǎn)志湯出自《圣濟(jì)總錄》[8]，遠(yuǎn)志性微溫、味苦辛，長于祛痰開竅、安神益智；石菖蒲性溫、味辛，善宣氣除痰、開竅醒神；二藥合用，相輔相成，使氣自順而壅自開，氣血不復(fù)上菀，痰濁消散，不蒙清竅，而神志自清。

前期研究[9]以遠(yuǎn)志、石菖蒲為君藥研制了院內(nèi)制劑“腦康Ⅱ號”，臨床觀察發(fā)現(xiàn)腦康Ⅱ號能有效改善腦缺血致血管性認(rèn)知障礙患者的學(xué)習(xí)、記憶功能。而應(yīng)用中藥小復(fù)方遠(yuǎn)志湯對慢性腦低灌注導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙進(jìn)行干預(yù)，既體現(xiàn)了中藥復(fù)方“多成分、多靶點(diǎn)”的優(yōu)勢，又便于深入分析藥物具體作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)研究[10-11]表明，遠(yuǎn)志湯的主要活性成分遠(yuǎn)志皂苷元以及石菖蒲的主要活性成分β-細(xì)辛醚均可以降低細(xì)胞凋亡率，保護(hù)海馬神經(jīng)元，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動物的學(xué)習(xí)記憶能力等方面的作用[12-13]。

在慢性腦低灌注的情況下，腦組織血流降低和代謝異常，可導(dǎo)致腦關(guān)鍵部位(尤其是海馬區(qū))缺血、缺氧，誘發(fā)神經(jīng)元損害，從而影響大腦的認(rèn)知功能，而細(xì)胞凋亡是引起海馬神經(jīng)元數(shù)目減少的重要原因之一[14]。凋亡使神經(jīng)元內(nèi)多種與凋亡有關(guān)的基因或蛋白酶激活，其中Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白，而Bcl-2相關(guān)X蛋白抗體Bax屬于促凋亡蛋白。研究[15-16]表明，Bc1-2/Bax的比值決定著缺血、缺氧狀態(tài)下細(xì)胞的存亡，另外，Caspase家族是一類直接引起凋亡細(xì)胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，其活化是凋亡執(zhí)行階段的重要環(huán)節(jié)。該家族成員Caspase-3 是哺乳動物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，處于凋亡級聯(lián)反應(yīng)的核心位置[17]。

本研究對大鼠采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎術(shù)造模，以模擬慢性腦低灌注的發(fā)生，在Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠的逃避潛伏期和搜索距離較正常對照組明顯延長；在空間探索實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠在原平臺所在象限搜索時間較正常對照組明顯縮短，說明模型組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損，造模成功。而遠(yuǎn)志湯可以明顯縮短大鼠的逃避潛伏期和搜索距離，并延長在原平臺所在象限搜索時間，表明遠(yuǎn)志湯可以提高慢性腦低灌注大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，遠(yuǎn)志湯可以降低大鼠海馬Bax和Caspase-3的表達(dá)，升高Bcl-2的表達(dá)，表明遠(yuǎn)志湯對慢性腦低灌注大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響可能與其對海馬凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的干預(yù)有關(guān)。中藥復(fù)方中各有效成分往往通過多種藥理途徑和藥效作用靶點(diǎn)，發(fā)揮防治疾病的作用[18-20]。因此，有必要開展進(jìn)一步的研究，從不同角度深入分析遠(yuǎn)志湯干預(yù)慢性腦低灌注導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制。