血漿miRNA-320C和miRNA-6088對Ⅱ型糖尿病腎病的診斷價值

王 蕤 吳素萍 徐品穎

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院臨床營養(yǎng)科， 北京 100029; 2.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院檢驗科， 北京 100029)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最常見的微血管合并癥，是終末期腎病的主要病因之一其基本特征是皮膚干燥，濕疹樣皮炎和劇烈瘙癢。DN起病隱匿，發(fā)展至終末期腎病的速度是其他腎病的14倍，因此早期診斷對改善生活質量，提高患者生存率具有重要意義。近年營養(yǎng)治療成為糖尿病治療必不可少的措施之一，更在DN治療中發(fā)揮重要作用。《糖尿病腎病防治專家共識(2014年版)》[1]強調飲食治療、醫(yī)學營養(yǎng)治療有利于減緩DN進展， 保護腎功能。眾所周知，DN的主要臨床特征是持續(xù)性蛋白尿、進行性腎小球濾過率降低和血壓升高[2]。其中蛋白尿是目前診斷DN最有用的生物標志物。然而，最近的研究[3]表明，蛋白尿可能不能準確預測DN，并且作為臨床相關性指標判斷慢性腎臟病替代終點有爭議。因此，目前探尋能夠準確表征DN患者疾病發(fā)生和進展的生物標志物成為營養(yǎng)學和內分泌學界的新焦點。

miRNA是一種高度保守的單鏈非編碼RNA，通過影響靶基因的轉錄和翻譯來調控細胞的生長、分化、增生和凋亡[4]。研究[5]顯示，DN患者腎組織或血清中miRNA-377、miRNA-146、miRNA-1303、miRNA-192、miRNA-216等的表達發(fā)生改變。而最近的研究[6]則顯示，糖尿病患者體內存在的持續(xù)高葡萄糖環(huán)境刺激體液中miRNA的表達發(fā)生變化，并且這些變化出現(xiàn)在蛋白尿之前。筆者認為miRNA的表達可能是糖尿病腎病診斷和預后的潛在的生物標志物。最近，miRNA-320(miR-320)被發(fā)現(xiàn)與糖尿病腎病和系統(tǒng)性微血管損傷相關，但卻在胰腺-腎臟移植后恢復正常[7]。另外，據(jù)報道[8]尿液中miR-320C和miRNA-6088(miR-6088)在Ⅱ型糖尿病腎病患者中過表達。因此，本研究通過檢測52例健康人，56例Ⅱ型糖尿病患者和105例Ⅱ型糖尿病腎病患者外周血miR-320C和miR-6088的表達，以探討miR-320C和miR-6088對Ⅱ型糖尿病腎病的診斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015年6月至2016年12月在首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院就診的161名Ⅱ型糖尿病患者，根據(jù)Mogenson分期標準[1]，將161名Ⅱ型糖尿病(type Ⅱ diabetic nephropathy, T2D)患者分為T2D組[n=56,尿蛋白排泄率(urinary albumin excretion rates，UAER) <20 μg/min]和DN組(n=105,UAER> 20 μg/min)，另選同時期體檢的健康人52例作為正常對照組(normal control,NC)。研究排除年齡65歲以上，繼發(fā)性糖尿病、惡性腫瘤、創(chuàng)傷、感染和自身免疫性疾病的患者，其他臨床資料如表1所示。

1.2 診斷標準

Ⅱ型DN診斷標準依據(jù)《糖尿病腎病防治專家共識(2014年版)》[1]，Ⅱ型糖尿病患者符合下列任何一項者：①大量白蛋白尿；②糖尿病視網(wǎng)膜病變伴任何一期慢性腎臟病即診斷為Ⅱ型DN。

1.3 臨床指標

所有患者于清晨空腹狀態(tài)下，抽取外周血5～10 mL，離心1 000 g，10 min(5810R，德國Eppendorf公司)收集血漿。全自動生化分析儀(AU680，美國Beckman Coulter公司)測量血清肌肝(serum creatinine,SCr)，總膽固醇(total cholesterol， TC)，三酰甘油(triglycerides， TG)，高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol， HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol， LDL-C)；血糖儀(ACCU-CHEK，瑞士Roche公司)測定餐后2 h血漿葡萄糖(2 h postprandial plasma glucose， 2 h PPG)和空腹血糖(fasting plasma glucose， FPG)；糖化血紅蛋白檢測儀(挪威AXIS-SHIELD公司)，測定糖化血紅蛋白(human glycated hemoglobin A1C, HbA1C)含量。

根據(jù)CKD-EPI公式[9]，估計腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)。GFR=a×(SCr/b)c×0.933×年齡; 女性：a=144，b=0.7，c =-0.329(當SCr≤0.7 mg/dl時)或c =-0.120 9(當SCr> 0.7 mg/dl時); 男性：a=141，b=0.9，c =-0.411(當SCr≤0.7 mg/dl時)或c =-1.209(當SCr> 0.7 mg/dl時)。分離RNA合成cDNA。PCR參數(shù)設置：16 ℃ 30 min, 37 ℃， 60 min和85 ℃ 5 s。

RT-qPCR：用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(日本TakaRa公司) 制備20 μL RT-qPCR系統(tǒng)，并使用ABI 7500熒光定量PCR儀器 (美國Applied Biosystems公司)進行擴增。PCR參數(shù)設置：95 ℃ 30 s，90 ℃ 5 s， 65 ℃ 30 s， 40個循環(huán)。以U6為內參，用2△t法(△t=CTmiRNA-CTU6)計算miR-320C和miR-6088的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)，對所有計量資料進行正態(tài)性檢驗。組間比較時資料滿足正態(tài)分布，采用方差分析，組間兩兩比較時采用LSD法；資料不滿足正態(tài)分布，采用秩和檢驗；分類資料采用χ2檢驗。資料正態(tài)分布的前提下采用Pearson相關分析，用于miRNA和其他臨床數(shù)據(jù)之間的相關性研究。受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線用于分析miR-320C或miR-6088對Ⅱ型糖尿病腎病的診斷價值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較

如表1所示，對NC、T2D和DN 3組患者的一般資料進行單因素方差分析，結果顯示，3組患者的糖尿病病程、體質量指數(shù)(body mass index, BMI)、平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)、FPG、HbA1C、TC、TG、LDL-C、UAER和eGFR差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對差異有統(tǒng)計學意義的指標進行兩兩比較，結果顯示DN組和NC組之間在BMI、MAP、FPG、HbA1C、TC、TG和LDL-C比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。DN組與T2D組相比，糖尿病病程、BMI、MAP、HbA1C、TG、LDL-C、UAER和eGFR均顯著升高(P<0.05)。T2D組與NC組相比，MAP、FPG、HbA1C、TC、TG和LDL-C差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 miR-320C和miR-6088在血漿中的表達

根據(jù)UAER的不同，105例DN患者被分為68例微量白蛋白尿(microalbuminuria,MA)患者(20 μg/min200 μg/min)。實時熒光定量PCR法檢測miR-320C和miR-6088的表達， NC組、T2D組、MA組和CP組的miR-320C平均表達水平分別為2.01±0.37、3.06±0.78、3.83±0.49和4.39±0.52，miR-6088平均表達水平分別為1.18±0.30、1.60±0.27、1.80±0.31和2.15±0.32，詳見圖1。

表1 3組研究對象一般資料比較Tab.1 Comparison of general data of 3 groups

2.3 miR-320C， miR-6088與DN患者臨床指標之間的相關性

為了研究miR-320C和miR-6088的臨床意義，通過SPSS 20.0分析了DN患者miR-320C和miR-6088與其他臨床指標之間的相關性。Pearson相關分析顯示，miR-320C與UAER呈正相關(r=0.633，P=0.012)，與eGFR呈負相關(r=-0.544，P=0.004)，而與血漿HbA1C濃度(r=-0.130，P=0.185)、TG(r=-0.185，P=0.059)、LDL-C(r=0.012，P=0.906)、糖尿病病程(r=-0.116，P=0.239)和體質量指數(shù)(body mass index，BMI)(r=0.08，P=0.417)不相關。miR-6088與UAER呈正相關(r=0.571，P=0.001)，與eGFR呈負相關(r=-0.570，P=0.000)，而與血漿HbA1C濃度(r=0.040，P=0.684)、TG(r=0.033，P=0.738)、LDL-C(r=-0.084，P=0.392)、糖尿病病程(r=-0.186，P=0.058)和BMI (r=-0.033，P=0.737)不相關。詳見表2和圖2、3。

圖1 miRNA-320C和miRNA-6088在不同人群中的表達Fig.1 Expression of miRNA-320C and miRNA-6088 in different populationsNC：normal control; T2D:type Ⅱ diabetic nephropathy; MA:microalbuminuria； CP：clinical proteinuria.

VariablesmiRNA-320CrPmiRNA-6088rPDM course-0.1160.239-0.1860.058BMI0.080.417-0.0330.737HbA1C-0.1300.1850.0400.684TG-0.1850.0590.0330.738LDL-C0.0120.906-0.0840.392UAER0.6330.0120.5710.001eGFR-0.5440.004-0.5700.000 DN:diabetic nephropathy; DM:diabetes mellitus; BMI:body mass index;HbA1C:hemoglobin A1C;TG:triglyceride;LDL-C:low density lipoprotein-cholesterol;UAER:urinary albumin excretion rates;eGFR:estimated glomerular filtration rate.

圖2 miRNA-320C， miRNA-6088和DN患者UAER濃度呈顯著正相關Fig.2 Positive correlation between the levels of miRNA-320C， miRNA-6088 and UAER in DN

2.4 miR-320C和miR-6088對DN的診斷價值

如圖4所示，miR-320C的ROC曲線下面積(areas under the ROC curve, AUC)為0.834，miR-6088的面積為0.753。當miR-320C，miR-6088的血漿濃度為3.45和1.695時，約登指數(shù)最大，因此miR-320C的診斷閾值為3.45(靈敏度88.6%，特異度64.3%)和miR-6088的1.695(靈敏度77.1% 特異度60.7%)。

圖3 miRNA-320C， miRNA-6088和DN患者eGFR濃度顯著負相關Fig.3 Negative correlation between miRNA-320C， miRNA-6088 and eGFR levels in DN

圖4 miRNA-320C和miRNA-6088診斷DN的ROC曲線Fig.4 ROC curves of miRNA-320C and miRNA-6088 for diagnosis of DNDN:diabetic nephropathy; ROC：receiver operating characteristic.

3 討論

糖尿病是由多種因素引起的慢性和代謝性疾病，分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅱ型糖尿病患者胰島β細胞功能隨著時間的推移逐漸下降，隨之而來的是許多合并癥。糖尿病腎病是糖尿病中最常見的損傷合并癥，大約30%的Ⅱ型糖尿病患者會轉化為DN，而約25%～45%的終末期腎病來自DN[10]。當DN患者發(fā)生腎功能衰竭時，不僅會給患者帶來巨大的身體疼痛，也會給社會和患者家庭帶來經(jīng)濟壓力。因此DN疾病發(fā)展的早期診斷和及時準確的評估疾病進展是非常重要的。最近的研究[11]表明，由微血管疾病引起的腎小球硬化是DN患者最重要的臨床特征，可以作為診斷DN的指標。營養(yǎng)治療是DN治療的重要措施之一[12]，一旦患者DN的診斷確定，隨之進行個體化的營養(yǎng)治療，包括根據(jù)透析與否及具體方式、頻度等進行總體熱量的設定，蛋白質、脂肪、碳水化合物能量配比，蛋白質種類和總量的設定以及運動方案的制定等一系列較無DN的糖尿病患者更為精細化的相關營養(yǎng)治療，以求最大限度的保護腎功能[13-14]。因此DN的診斷成為無DN的糖尿病患者和DN患者營養(yǎng)治療的分水嶺，具有重要意義。本研究正基于此對DN早期診斷進行生物學標志物探究，以期早期干預，改善預后。

miRNAs是21到24個核苷酸組成的非編碼小RNA，廣泛存在于動物和植物中。miRNA可以通過降解或抑制mRNA的翻譯來調節(jié)靶基因轉錄水平。同時，miRNA可以在血液或其他體液中穩(wěn)定表達，并且在某些疾病中miRNA的表達會發(fā)生改變，如miRNA-21和miRNA-23a在兒童Burkitt淋巴瘤中上調[15]；miRNA-31在肺癌患者中的表達顯著高于健康人，并與肺癌患者的生存時間相關[16]。近年來，一些研究表明miRNA與DN相關，MiRNA-23b在血漿和腎臟T2D患者中下調，并且在高葡萄糖環(huán)境的腎細胞中表達下調[17]。Putta等[18]報道m(xù)iRNA-192在DN患者腎臟組織中表達上調，抑制miRNA-192的表達將有助于改善DN中的腎纖維化。另有文獻[19]報道下調miRNA-21可減少DN炎性反應和足細胞的調亡。筆者認為miRNA不僅可以幫助了解DN的復雜病理，還可以作為診斷DN的生物標志物。

本文研究顯示，DN患者血漿miR-320C和miR-6088的表達顯著高于健康人群和T2D患者(P<0.05)。并且出現(xiàn)臨床蛋白尿的DN患者血漿miR-320C和miR-6088的表達要顯著高于微量白蛋白尿DN患者(P<0.05)。在DN患者中miR-320C和miR-6088的表達與UEAR呈正相關，與eGFR呈負相關。UAER和eGFR是診斷糖尿病腎病的兩個關鍵指標，所以miR-320C和miR-6088可能是糖尿病腎病的潛在診斷指標。

mi-320C基因位于人染色體18q11.2上，與血管微環(huán)境[20]、癌癥[21]和左心室重塑[22]密切相關。研究[23]表明，miR-320C參與了骨髓干細胞分化的調控，并且阻礙了膀胱癌細胞的增生、凋亡、遷移和侵襲[21]。mi-6088基因位于人染色體19q13.32上，是一個新發(fā)現(xiàn)的miRNA。目前關于miR-6088的研究很少，只是Deli等[8]報道尿液外泌體miR-6088在Ⅱ型糖尿病腎病患者中過度表達。從以上結果和敘述中可以看出，miR-320C和miR-6088與Ⅱ型糖尿病腎病相關。為了評估m(xù)iR-320C和miR-6088對Ⅱ型糖尿病腎病的診斷價值，筆者計算了miR-320C和miR-6088診斷Ⅱ型糖尿病腎病ROC曲線的AUC。本研究顯示，miR-320C的AUC為0.834，診斷DN的靈敏度為88.6%，特異度為64.3%；miR-6088的AUC為0.753，診斷DN的靈敏度為77.1%，特異度為60.7%。此前有研究[24]顯示miRNA-21作為DN診斷的潛在分子生物學標志物，診斷DN的靈敏度和特異度分別為76.0% 和 77.3%。miR-320C和miR-6088診斷DN的靈敏度均高于miRNA-21，但特異度較之略差。其次，本研究顯示T2D組和NCXEGGMA組和T2D組，CP組和MA組比較，miR-320C和miR-6088的表達均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義，且miR-320C和miR-6088與UAER均呈正相關，與eGFR均呈負相關。鑒于現(xiàn)階段臨床中DN的早期診斷仍然主要依靠UAER，故考慮miR-320C和miR-6088可能是DN潛在的早期生物學指標。本研究還顯示當miR-320C、miR-6088的血漿濃度為3.45 pg/mL和1.695 pg/mL時，約登指數(shù)最大，故推測miR-320C的診斷閾值為3.45，miR-6088的診斷閾值為1.695。鑒于本研究研究例數(shù)有限，故仍需后續(xù)大量數(shù)據(jù)研究，再次驗證和確定是否能以此閾值作為診斷DN的新生物標志物的標準閾值。

綜上所述，血漿miR-320C和miR-6088在Ⅱ型糖尿病腎病中高表達，并與糖尿病腎病的嚴重程度密切相關，是Ⅱ型糖尿病腎病患者潛在的生物標志物。