人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞治療小鼠流產(chǎn)的效果研究

周 平 劉 程 王秋石 朱志清 曹廣明 劉崇東 張震宇*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院手術(shù)室， 北京 100020；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院婦產(chǎn)科， 北京 100020)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指孕22周前發(fā)生的同一性伴侶連續(xù)3次及3次以上的自然流產(chǎn)，在育齡婦女中發(fā)生率約1%～3%[1]，有RSA病史的婦女，早產(chǎn)率、胎兒子宮內(nèi)發(fā)育遲緩和新生兒低出生體質(zhì)量的風(fēng)險(xiǎn)均較一般人群高[2]。因此，RSA不僅危害婦女的身心健康，對(duì)其生育的下一代也有不良影響。引起 RSA的病因較多，隨著生殖免疫學(xué)研究的不斷發(fā)展，母胎界面局部免疫調(diào)節(jié)因素異常被認(rèn)為是RSA的主要原因[3]。間充質(zhì)干細(xì)胞具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)能力，胎盤提取的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量眾多，質(zhì)量穩(wěn)定，已被應(yīng)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡等嚴(yán)重免疫性疾病的患者，有效地控制了疾病的進(jìn)展[4-6]。因此，本研究利用經(jīng)典高危的流產(chǎn)小鼠模型(CBA/J雌性×DBA/2J雄性)，通過計(jì)算胚胎吸收率、胎鼠質(zhì)量及胎盤質(zhì)量等觀察人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(placenta-derived mesenchymal stem cells, PMSC)治療RSA小鼠的效果，從而為RSA患者的治療提供新的治療方法及治療思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：CBA/J雌性×DBA/2J雄性小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。6～8周齡清潔級(jí)雌性CBA/J小鼠12只，雄性DBA/2J小鼠6只。

2)人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞：購自博雅干細(xì)胞公司，為原代培養(yǎng)的第5代細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，CD73、CD90和CD105表達(dá)陽性，CD11b、CD34、CD45、CD19、HLA-DR表達(dá)陰性，符合間充質(zhì)干細(xì)胞特性。

3)實(shí)驗(yàn)試劑：兔抗鼠單克隆CK8抗體、兔抗鼠多克隆Laminin 抗體購自美國Abcam公司。免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 CBA/J雌性×DBA/2J雄性小鼠模型和人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞移植方法

雌性CBA/J小鼠與雄性DBA/2J小鼠按2∶1比例合籠交配，建立妊娠小鼠模型，小鼠于晚上6點(diǎn)合籠，次日上午8點(diǎn)檢查陰栓，檢出陰栓者記為妊娠第0.5天；未檢出者繼續(xù)交配，如2 d后未檢出陰栓，將雌性小鼠和雄性小鼠分開飼養(yǎng)3 d后再次合籠，如此反復(fù)，直至檢出陰栓為止。將檢出陰栓的小鼠12 只分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組于孕第1天經(jīng)尾靜脈注射PBS 0.2 mL；實(shí)驗(yàn)組于孕第1天經(jīng)尾靜脈注射0.2 mL PBS重懸的1×106個(gè)人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。

1.3 胚胎吸收率計(jì)算方法

見栓后13 d處死小鼠，具體方法：麻醉兩組小鼠，暴露雙側(cè)子宮，觀察各組胚胎著床情況，計(jì)數(shù)胚胎吸收率。胚胎吸收的判定標(biāo)準(zhǔn)：胚胎體積與對(duì)照組相比減小，子宮呈“竹節(jié)”狀，或胚胎完全吸收至未孕狀態(tài)，胚胎-胎盤單位有明顯淤血、組織變性或壞死，上述現(xiàn)象出現(xiàn)其一即判定為胚胎吸收。胚胎吸收率=胚胎吸收數(shù)/(胚胎吸收數(shù)+胚胎存活數(shù))×100%。

1.4 比較兩組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵潤情況

取兩組各3只小鼠娩出胎盤組織，每只小鼠留取3個(gè)胎盤， 置10%(體積分?jǐn)?shù))中性甲醛溶液固定24 h以上。常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚度為6 μm。石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化， PBS液沖洗。采用SP法(二步法)免疫組織化學(xué)染色。兔抗鼠單克隆CK8抗體的工作濃度為1∶200、兔抗鼠多克隆Laminin 抗體的工作濃度為1∶250， 操作步驟均按試劑盒說明書要求進(jìn)行。

分析了來自5只孕鼠的5個(gè)胎盤，每個(gè)胎盤隨機(jī)取5個(gè)視野進(jìn)行拍照，借助Image Plus 軟件計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析胎兒血管(fetal blood vessel，F(xiàn)BV)面積和母體血竇(maternal blood sinus，MBS)面積， 同時(shí)對(duì)浸潤到蛻膜組織的CK8陽性滋養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，并測量蛻膜層中CK8陽性滋養(yǎng)細(xì)胞與海綿層基線的距離。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組胚胎吸收率比較

實(shí)驗(yàn)組共有6只雌鼠妊娠，胚胎存活60個(gè)、胚胎吸收5個(gè)、胚胎吸收率為8.3%，對(duì)照組共有6只雌鼠妊娠，胚胎存活60個(gè)、胚胎吸收17個(gè)、胚胎吸收率為28.3%，實(shí)驗(yàn)組的胚胎吸收率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.01，P=0.005)。各組妊娠子宮形態(tài)及胎鼠和胎盤對(duì)比見圖1。

A：morphology of uterine of pregnant mice of control group;B：morphology of fetus and placenta of control group;C:morphology of uterine of pregnant mice of experimental group；D:morphology of fetus and placenta of control group of experimental group.

2.2 各組胎鼠及胎盤重量比較

實(shí)驗(yàn)組胎鼠質(zhì)量為(1 185.57±87.92)g，胎盤質(zhì)量為(674.36±66.29)g。對(duì)照組的胎鼠質(zhì)量為(981.57± 118.25)g，胎盤質(zhì)量為(572.25±89.25)g。實(shí)驗(yàn)組的胎鼠及胎盤質(zhì)量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，詳見表1。

表1 兩組胎鼠和胎盤質(zhì)量比較Tab.1 Comparison of the quality of fetal and placenta

2.3 兩組小鼠胎盤迷路層的結(jié)構(gòu)分析

以層黏連蛋白Laminin標(biāo)記胎兒血管，可見與實(shí)驗(yàn)組相比，對(duì)照組胎盤中胎兒血管分支明顯減少，胎兒血管總面積以及母體血竇總面積均顯著降低(圖2)。

2.4 滋養(yǎng)層細(xì)胞侵潤能力的變化比較

用滋養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)記分子CK8對(duì)胎盤切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，對(duì)侵潤到蛻膜組織的CK8陽性滋養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組；測量蛻膜層中CK8陽性滋養(yǎng)細(xì)胞與海綿層基線的距離，實(shí)驗(yàn)組滋養(yǎng)細(xì)胞向蛻膜遷移的距離顯著遠(yuǎn)于對(duì)照組(圖3)。

圖2 兩組胎兒血管總面積以及母體血竇面積比較Fig.2 Comparison of total area of fetal blood vessel and maternal sinus area

A: Immunohistochemistry results show the distribution of Laminin in placenta of control group;B: Immunohistochemistry results show the distribution of Laminin in placenta of experimental group;C: Fetal blood vessels (red) area and the maternal blood sinus (blue) area were calculated by Image J plus software of control group ;D: Fetal blood vessels (red) area and the maternal blood sinus (blue) area were calculated by Image J plus software of experimental group.E: analysis of lbayrinth layer，**P<0.01.

3 討論

引起 RSA的病因較多，目前認(rèn)為RSA的病因包括遺傳因素，感染因素、解剖學(xué)異常、內(nèi)分泌因素、免疫功能異常、血栓前狀態(tài)等，其中近50%的RSA與免疫相關(guān)[7]，母胎界面局部免疫調(diào)節(jié)因素異常被認(rèn)為是RSA的主要原因[8]。

母體對(duì)半同種異體胚胎的免疫耐受是成功妊娠的關(guān)鍵因素，多種免疫細(xì)胞，如NK細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等以及多種免疫調(diào)節(jié)因子均參與了母胎界面的局部免疫調(diào)節(jié)，而任一免疫細(xì)胞或免疫調(diào)節(jié)因子的失衡，均會(huì)導(dǎo)致母胎界面的免疫不耐受，而致流產(chǎn)。針對(duì)同種免疫型RSA，既往多種免疫治療方法，如集落刺激因子(granular colony stimulating factor，C-CSF)和丙種球蛋白等均經(jīng)歷了臨床實(shí)踐研究階段，只在部分患者中取得治療效果，且經(jīng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)分析大量數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)這些免疫治療方法并沒有降低RSA患者的流產(chǎn)率及提高活產(chǎn)率[9-10]。說明免疫功能異常相關(guān)的RSA患者，單一、定向的方法調(diào)節(jié)某一種細(xì)胞或細(xì)胞因子，可能不能達(dá)到預(yù)期的效果。說明RSA的免疫治療可能需要更深層次或者更全面的免疫功能調(diào)節(jié)方法。

圖3 兩組CK8表達(dá)陽性的滋養(yǎng)細(xì)胞侵潤情況比較Fig.3 Comparison of invasion of CK8(+) cells between two groups

A: Immunohistochemistry for Cytokeratin 8 in the placenta of control group;B: Immunohistochemistry for Cytokeratin 8 in the placenta of experimental group;C: Number of Cytokeratin 8-positive cells in the deciudal tissues and distance of cytokeratin positive cells from the base line of spongiotrophoblast region of control group;D: Number of Cytokeratin 8-positive cells in the deciudal tissues and distance of cytokeratin positive cells from the base line of spongiotrophoblast region of experimental group;E: Comparison of invasion of CK8(+) cells，**P<0.01

干細(xì)胞作為重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，已被證實(shí)可以有效調(diào)節(jié)免疫功能，在治療自身免疫系統(tǒng)疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病等，以及抑制移植物抗排異反應(yīng)方面具有突出效果[4-6]。間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，屬于非終末分化細(xì)胞，它既有間質(zhì)細(xì)胞，又有內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞的特征。間充質(zhì)干細(xì)胞在體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、軟骨、骨、肌肉、肌腱、神經(jīng)、肝、心肌、胰島β細(xì)胞和內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。目前的臨床應(yīng)用方向，主要包括器官或組織的修復(fù)以及免疫系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)兩方面。作為免疫調(diào)節(jié)主要應(yīng)用于促使造血干細(xì)胞移植物的植入以及治療移植物抗宿主??；另外，應(yīng)用于自身免疫病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等，取得了良好的臨床治療效果。

本研究采用CBA/J雌鼠與DBA/2J雄鼠交配制作RSA小鼠模型，已有研究[11-12]經(jīng)證實(shí)該模型雌性小鼠妊娠后，在胚胎著床早期，母體血液系統(tǒng)和母胎界面局部均存在免疫功能異常，包括NK細(xì)胞和T細(xì)胞異常激活，共刺激因子增加，補(bǔ)體沉積增加，以及和炎性反應(yīng)相關(guān)的淋巴細(xì)胞活動(dòng)增加等[11-12]。因此本研究擬利用該模型，在見栓后對(duì)雌性小鼠進(jìn)行尾靜脈注射PMSC，通過PMSC的免疫調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)雌性小鼠的全身及局部的免疫功能，通過計(jì)算各組小鼠的胚胎吸收率以及比較各組胎鼠及胎盤的質(zhì)量，結(jié)果顯示PMSC可以增強(qiáng)母鼠的免疫耐受能力，降低免疫系統(tǒng)對(duì)胚胎的排斥反應(yīng)，增加了滋養(yǎng)細(xì)胞向子宮蛻膜的侵潤能力，顯著提高胚胎的著床能力，從而降低胚胎的吸收率。

綜上所述，PMSC能夠降低RSA小鼠的胚胎吸收率，增加胎鼠及胎盤質(zhì)量，改善妊娠結(jié)局，為實(shí)現(xiàn)自然流產(chǎn)的早期預(yù)防和治療提供了新的方向。