東北酸菜中乳酸菌的分離鑒定及特性研究

◆作者：李曉穎

◆單位：山東鳳凰生物有限公司，山東泰安271000

東北酸菜是我國傳統(tǒng)特色的發(fā)酵食品。許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)東北酸菜中含有多種活性乳酸菌，具有發(fā)酵酸菜、產(chǎn)酸、產(chǎn)細(xì)菌素的能力。乳酸菌作有助于動(dòng)物機(jī)體內(nèi)胃腸道正常棲居菌的生長和定植，直接或間接影響其它微生物種群，是一種安全、優(yōu)質(zhì)、高效的益生菌，其目前應(yīng)用于飼料添加劑的乳酸菌主要有植物乳桿菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌等。

近年來研究報(bào)道，一些乳桿菌類對一些常見抗生素有不同程度耐受性，個(gè)別菌株甚至出現(xiàn)了多重耐藥性問題。當(dāng)具有耐藥性的菌株以食物形式進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后，可能會(huì)通過基因水平轉(zhuǎn)移等途徑將耐藥基因傳遞給其他腸道內(nèi)生菌或致病菌，從而間接對人類健康造成潛在威脅。目前，篩選對生長性能好、產(chǎn)酸能力強(qiáng)、對抗生素不敏感的的優(yōu)良菌株尤是益生菌行業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)之一。為此本實(shí)驗(yàn)對東北酸菜中產(chǎn)酸性能好的菌株進(jìn)行了篩選及特性研究，以期獲得優(yōu)良菌株的實(shí)驗(yàn)菌株，為乳酸菌在畜禽養(yǎng)殖、食品以及生物制品中的進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 酸菜樣品

實(shí)驗(yàn)所用東北酸菜為同事贈(zèng)予，采自吉林農(nóng)家自制酸菜。樣品采集于滅菌大三角瓶中，封好放入冰盒內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室于4℃冰箱中保存，盡快進(jìn)行乳酸菌的擴(kuò)培及分離。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

基因組DNA提取試劑盒、Mixture等購自北京天根生化科技有限公司；溶菌酶購自大連寶生物工程有限公司；豬膽鹽購自上海索萊寶生物科技有限公司；改良MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基按常規(guī)配方配制，所需其他試劑及溶液均按常規(guī)自行配制。

1.1.3 指示菌株

金黃色葡萄球菌、沙門氏菌均為實(shí)驗(yàn)室保存菌株；雞大腸桿菌O78為山東農(nóng)大老師贈(zèng)送。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分菌純化

取適量的酸菜至100 mL的MRS液體培養(yǎng)基中37℃富集培養(yǎng)20 h，用接種針蘸取培養(yǎng)液在含CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基劃線，37℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h后，挑取培養(yǎng)基上具有明顯透明圈的單菌落，接種在斜面上培養(yǎng)，然后進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

1.2.2 菌株鑒定

目的菌株接種于新鮮的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h，按照北京天根“細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒”說明書提取菌體DNA，采用通用引物，并以其為模板擴(kuò)增16S rDNA基因組序列。將PCR產(chǎn)物送北京博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定，將獲得16S rDNA基因序列在NCBI進(jìn)行 BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比對。

1.2.3 產(chǎn)酸及抑菌能力測定

將目的菌株種子液以2%接種量接種到初始pH值一致的MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)20 h后，測定發(fā)酵液的pH值。將純菌培養(yǎng)液以4000 r/min離心30 min，取其上清液，采用牛津杯法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.4 耐酸耐膽鹽能力測定

菌株活化2代后的液體培養(yǎng)物按2%的接種量接種于pH=3的滅菌 PBS中，37℃培養(yǎng)。分別于1、2 h取菌懸液，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算乳酸菌的存活率，以pH 5.5～6.0的菌液為對照。同時(shí)按2%的接種量接種于膽鹽濃度為0.3%（w/v）的MRS培養(yǎng)基中，以不加膽鹽的MRS培養(yǎng)基為對照，37℃培養(yǎng)，分別于1、2 h取菌懸液，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算乳酸菌存活率。

1.2.5 抗生素耐藥譜測定

將純化的菌體劃線取單菌落，懸于3 mL生理鹽水中，調(diào)整菌體濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝弧Ｓ脽o菌棉簽均勻涂布MRS培養(yǎng)基表面，用滅菌鑷子取藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)18～24 h后取出，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

1.2.6 生長曲線

將鑒定后所需菌株發(fā)酵液以4%接種量接種到于改良的MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)，于 0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h取樣測定pH值以及活菌數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的活菌數(shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 酸菜中菌株分離純化及鑒定結(jié)果

5株菌的16S rDNA PCR電泳圖如圖1所示，條帶在1000～2000bp之間，約為1500bp。

圖1 菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳結(jié)果

將 5 株 菌 DB-1、DB-2、DB-3、DB-4、DB-5 的 16S rDNA在NCBI中進(jìn)行BLAST序列比對，結(jié)果顯示：DB-1、DB-4、DB-5的16S rDNA基因序列與植物乳桿菌Lactobacillus plantarum有較高的同源性（100%）；DB-2、DB-3的 16S rDNA 基因序列與棒狀乳桿菌Lactobacillus coryniformis有較高的同源性（100%）。鑒于棒狀乳桿菌還未允許應(yīng)用于飼料行業(yè)中應(yīng)用，后期只進(jìn)行植物乳桿菌的特性研究。

2.2 產(chǎn)酸及抑菌能力測定

3株植物乳桿菌發(fā)酵液的pH及抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，不同菌株發(fā)酵后的培養(yǎng)液pH有一定的差異，3株菌株對大腸桿菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制效果，其對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑制效果好于對沙門氏菌的抑制效果。

2.3 耐酸耐膽鹽能力測定

3株植物乳桿菌發(fā)酵后活菌數(shù)及耐酸耐膽鹽能力如表2所示。

通過表2看出，3株植物乳桿菌的耐酸能力較強(qiáng)，2h內(nèi)的存活率均高于94%，其中DB-5的耐酸能力最強(qiáng)，2h的存活率為98.9%；耐膽鹽能力相對較弱，2h內(nèi)存活率最高的為 DB-1，為55.8%。

2.4 抗生素耐藥譜測定

3株植物乳桿菌對不同抗生素的藥敏圈直徑結(jié)果如表3所示。

表1 3株植物乳桿菌發(fā)酵液產(chǎn)酸及抑菌能力(單位：mm)

表2 3株植物乳桿菌發(fā)酵后活菌數(shù)及耐酸耐膽鹽測定結(jié)果

表3 3株植物乳桿菌對6抗生素敏感性測定結(jié)果(單位：mm)

通過測定3株植物乳桿菌對6種抗生素的敏感性，結(jié)果顯示：3株植物乳桿菌均對萬古霉素具有耐藥性；其中僅有DB-5對青霉素具有抗性，另外兩株則具有很好的敏感性。結(jié)合3株菌的產(chǎn)酸、抑菌、生長特性、耐酸耐膽鹽能力綜合考慮保留DB-1進(jìn)行后期生長曲線摸索。

2.5 DB-1生長曲線測定

通過測定不同時(shí)間段的pH及活菌數(shù)，所繪制生長曲線如圖2所示。

圖2 DB-1實(shí)驗(yàn)室生長曲線

由圖可以看出，在0-10 h內(nèi)菌體生長迅速，在4h左右進(jìn)入對數(shù)期，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期，且持續(xù)時(shí)間較長，并在12 h時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大值1.9×109CFU/mL，后期進(jìn)入穩(wěn)定期，到28h，活菌數(shù)下降不明顯，菌體一直處于穩(wěn)定期內(nèi)。

3 結(jié)論與討論

微生態(tài)制劑包含益生菌及其代謝物和促生長物質(zhì)，具有協(xié)調(diào)、維持人和動(dòng)物機(jī)體的微生態(tài)平衡的作用。其代謝物如：酶、維生素等物質(zhì)能促進(jìn)動(dòng)物營養(yǎng)吸收及生長發(fā)育。目前微生態(tài)制劑在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中已有較多的應(yīng)用，在增加動(dòng)物機(jī)體體重，提高免疫力方面發(fā)揮了很好的功效。尹清強(qiáng)（2014）研究發(fā)現(xiàn)飼喂復(fù)合微生態(tài)制劑，能增加胃腸道內(nèi)乳酸菌的數(shù)量，降低大腸桿菌的數(shù)目，提高其免疫球蛋白的數(shù)量。楊龍龍（2014）分離獲得的乳酸菌能顯著抑制大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的增長，可降低奶牛的腹瀉率，提高其免疫力及增重。

益生菌經(jīng)口服進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體，必須先經(jīng)過胃然后到小腸定植，因此益生菌只有能夠抵抗較強(qiáng)的酸性環(huán)境和較高濃度的膽鹽才能使其在腸道中存活和正常發(fā)揮作用。從東北酸菜中分離出5株菌株，經(jīng)分子鑒定DB-1、DB-4、DB-5為植物乳桿菌，DB-2和DB-3為棒狀乳桿菌，后期僅對3株植物乳桿菌進(jìn)行特性研究。通過測定3株植物乳桿菌的產(chǎn)酸、抑菌、活菌數(shù)及對抗生素的敏感性，篩選出特性較好的株DB-1。該菌在在pH值為3的條件下，2h的存活率為98.2%；0.3%膽鹽濃度下2h的存活率為55.8%，說明該菌株具有較強(qiáng)的耐酸和耐膽鹽能力。對雞大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及沙門氏菌的抑菌結(jié)果顯示：該菌對3種致病菌的抑菌結(jié)果較好，尤其是對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力顯著。通過測定該菌的生長曲線顯示：該菌生長較快，在4 h左右進(jìn)入對數(shù)期，12 h時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大值1.9×109CFU/mL，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期，且持續(xù)時(shí)間較長，可作為優(yōu)良的益生菌候選菌。

許多研究者都指出，商用乳酸菌若不經(jīng)過嚴(yán)格的安全性篩選，后期應(yīng)用過程中很可能會(huì)擔(dān)當(dāng)耐藥性基因貯存宿主的角色。石磊等（2014）通過檢測不同品牌酸奶的菌株對抗生素的耐受性，發(fā)現(xiàn)所有菌株均出現(xiàn)多重耐受性；馬沁沁等（2015）研究發(fā)現(xiàn)四川地區(qū)人腸道及發(fā)酵食品中的52株乳桿菌，60%以上的菌株分別對諾氟沙星、萬古霉素、紅霉素和環(huán)丙沙星具有耐藥性。隨著生活水平的不斷改善，消費(fèi)者對畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量要求越來越高，歐盟已經(jīng)采取了抗生素相關(guān)限用、禁用政策，同時(shí)分析乳酸菌對不同抗生素藥物的敏感性，能幫助了解不同抗生素對乳酸菌的影響，為產(chǎn)品的日常合理應(yīng)用提供參考。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是我國衛(wèi)生部公布的《可用于生產(chǎn)普通食品的菌種名單》中的菌種，因此本研究所獲得的DB-1具有作為益生菌的良好潛質(zhì)，亦可用于食品中。篩選安全且對機(jī)體有效的乳酸菌，并實(shí)驗(yàn)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)，是益生菌行業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)方向之一，相信隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，微生態(tài)制劑作為新型的飼料添加劑將有更加廣闊的應(yīng)用前景

參考文獻(xiàn)：（略）