羅非魚羅湖病毒RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

雷 燕，肖 洋，趙振峰，唐紹林，黎建斌，陳福艷

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羅非魚羅湖病毒RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

雷 燕1,2，肖 洋1,2，趙振峰1,2，唐紹林1,2，黎建斌3，陳福艷3

（1. 廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司，廣東 廣州 510515；2. 廣州金水動(dòng)物保健品有限公司，廣東 廣州 510515；3. 廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院 廣西遺傳育種與健康養(yǎng)殖遺傳重點(diǎn)試驗(yàn)室，廣西 南寧 530021）

【】建立快速檢測羅非魚羅湖病毒（Tilapia Lake Virus，TiLV）的RT-PCR方法?！尽繀⒄誈enBank中羅非魚羅湖病毒全基因序列，依據(jù)其假定蛋白基因片段3設(shè)計(jì)合成1對(duì)特異性擴(kuò)增引物，提取羅湖病毒RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過優(yōu)化擴(kuò)增條件和擴(kuò)增體系，建立快速檢測羅非魚羅湖病毒的RT-PCR方法。用該方法對(duì)自然感染羅湖病毒發(fā)病的羅非魚樣品進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增?！尽縍T-PCR擴(kuò)增得到與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的499 bp的特異性目的條帶，而對(duì)健康羅非魚、野生羅非魚及其他病毒對(duì)照組的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。測序比對(duì)結(jié)果表明，該方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確，最低可檢測出約10 fg/mL的質(zhì)粒DNA，具有較好的特異性和較高的敏感性。用該方法對(duì)332份臨床樣品進(jìn)行RT-PCR檢測，其中36份樣品擴(kuò)增出特異性的目的條帶，經(jīng)測序比對(duì)，檢測結(jié)果正確?！尽拷⒌臋z測方法可用于TiLV的檢測。

羅非魚；羅湖病毒；快速檢測；RT-PCR

羅非魚羅湖病毒（Tilapia Lake Virus，TiLV），是近年來發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的一種新病毒，最早于2009年在以色列被檢測到[1-2]，已相繼在以色列[3]、哥倫比亞[4]、厄瓜多爾[4]、埃及[5]和泰國[6]發(fā)現(xiàn)。該病原體雖不會(huì)引起公共衛(wèi)生問題，但可導(dǎo)致受感染種群大量死亡。據(jù)報(bào)道，該病毒傳染性較強(qiáng)，已造成以色列、厄瓜多爾、哥倫比亞等養(yǎng)殖羅非魚大面積死亡，死亡率高達(dá)80% ~ 90%，在埃及則造成5% ~ 15%的死亡[6]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織發(fā)布的消息，TiLV可能比目前已知的分布范圍更廣，給全球羅非魚養(yǎng)殖造成嚴(yán)重威脅，目前已引起多個(gè)國家的重視。

TiLV是一種負(fù)鏈RNA病毒，基因組由10個(gè)獨(dú)立的基因片段組成，目前仍未確定其分類地位，極可能是正黏病毒科一種新型病毒[6]。其適宜生長溫度為24 ~ 33 ℃，最適生長溫度25 ℃[2]。目前尚無針對(duì)性疫苗和有效治療措施報(bào)道。2017年5月，本課題組首次從國內(nèi)養(yǎng)殖的羅非魚中檢測出該病毒[7]。目前，羅湖病毒檢測僅見巢式PCR檢測方法[8]。本研究依據(jù)TiLV的假定蛋白（Hypothetical protein）基因segment 3的基因序列，建立針對(duì)TiLV的RT-PCR檢測方法，為其臨床對(duì)該病的診斷提供一種快速、敏感、準(zhǔn)確的技術(shù)手段，有利于TiLV早期感染階段的檢測和流行病學(xué)的調(diào)查。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚

TiLV陽性材料采自海南省文昌市潭牛鎮(zhèn)某羅非魚養(yǎng)殖池塘，由廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司水產(chǎn)動(dòng)物疾控中心實(shí)驗(yàn)室（下稱“本實(shí)驗(yàn)室”）收集、PCR擴(kuò)增和測序鑒定并保存。野生未發(fā)病羅非魚樣品采集自廣東省珠海市，養(yǎng)殖未發(fā)病羅非魚采自廣東省廣州市。

1.2 實(shí)驗(yàn)用毒株

錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）、鯉皰疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirus II，CyHV-2）、真鯛虹彩病毒（Red-sea bream iridovirus，RSIV）、傳染性脾腎壞死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）的DNA和草魚出血病病毒（Grass carp reovirus，GCRV）、鯉春病毒血癥病毒（Spring viremia of carp virus，SVCV）、神經(jīng)壞死病毒（Nervous necrosis virus，NNV）的cDNA均由本實(shí)驗(yàn)室收集、保存。臨床樣品分別采自海南、廣東、云南、廣西等地羅非魚養(yǎng)殖池塘，計(jì)332份。

1.3 主要試劑

2×Taq PCR MasterMix、大腸桿菌（）DH5α感受態(tài)細(xì)胞、高純度質(zhì)粒小提試劑盒、大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等購自天根生化科技（北京）有限公司。DNA分子標(biāo)準(zhǔn)DL2000、pMD19-T載體、RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT Reagent Kit等購自寶生物工程（大連）有限公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中TiLV分離株Til-4-2011的假定蛋白基因segment 3的基因序列（GenBank登錄號(hào)：KU751816），應(yīng)用DNAStar 5.0和Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，預(yù)期擴(kuò)增目的基因片段長度為499 bp。正向引物F：5′-GAATAATAAAGT GAGCTTAAG-3′，反向引物R：5′-CAGGGAAAG TACTGCATAGCG-3′。引物由華大基因（廣州）科技股份有限公司合成。

1.5 病毒RNA的提取

分別取TiLV陽性羅非魚的鰓、肝臟、脾臟、腎臟等組織100 mg，加入600 μL滅菌ddH2O，用玻璃勻漿器充分勻漿研磨，于-80℃至室溫反復(fù)凍融3次，將組織勻漿液以12 000 r/min、4 ℃條件離心10 min，取上清液400 μL，加入RNAiso Plus 400 μL，充分振蕩，室溫下靜置5 min。加入氯仿120 μL，用力振蕩10 s，室溫下靜置10 min，以4 ℃、12 000 r/min條件離心10 min，取上清液，加入等體積異丙醇充分混勻，靜置15 min，以4 ℃、12 000 r/min條件離心15 min。棄上清液，加入1 mL -20 ℃下預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇，充分混勻，以4 ℃、12 000 r/min條件離心5 min，棄上清液，于室溫下干燥10 min，加入DEPC處理水60 μL溶解，- 80℃下保存。野生未發(fā)病羅非魚、養(yǎng)殖未發(fā)病羅非魚及待檢發(fā)病羅非魚樣品同法抽提RNA。

1.6 RT-PCR檢測方法的建立

逆轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)體系（10 μL）：1 μg/mL RNA 模板7 μL，5×PrimeScriptBuffer 2 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL、Random 6 mers 0.5 μL。反應(yīng)程序：于37 ℃下逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min，85 ℃下滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5 s，4 ℃下保存，得cDNA產(chǎn)物。

PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：2×Taq PCR MasterMix 10 μL、滅菌ddH2O 6 μL、cDNA模板3 μL和10 mmol/L上下游引物各0.5 μL。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃下保存。結(jié)果用12 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 陽性重組質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收試劑盒純化回收，與pMD19-T 載體連接后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)板上，于37℃下培養(yǎng)12～16 h，挑取單個(gè)菌落，增菌后用小量質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR分析鑒定，篩選出陽性重組質(zhì)粒送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序。

1.8 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化

分別用寶生物公司的DNA聚合酶試劑盒及天根的PCR預(yù)混液優(yōu)化Mg2+濃度、dNTPs濃度、酶濃度等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)Mg2+濃度、dNTPs濃度、酶濃度等指標(biāo)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果幾無影響；因此，反應(yīng)體系僅優(yōu)化引物濃度和模板濃度指標(biāo)。

10 mmol/L上下游引物分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 μL，PCR產(chǎn)物電泳后確定引物濃度。

模版分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL，PCR產(chǎn)物電泳后確定模板濃度。

分別以45.0、46.2、48.9、52.7、57.6、61.6、63.8、65.0 ℃作為退火溫度進(jìn)行PCR，產(chǎn)物電泳后確定退火溫度。

1.9 RT-PCR特異性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的RT-PCR方法分別對(duì)自然感染TiLV發(fā)病的羅非魚、健康羅非魚、野生羅非魚、KHV、CyHV-2、RSIV、ISKNV、GCRV、SVCV、NNV的DNA和cDNA進(jìn)行檢測，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.10 RT-PCR敏感性試驗(yàn)

測定構(gòu)建的pMD19-CMNV質(zhì)粒濃度，將重組質(zhì)粒稀釋成1 ng/mL，再進(jìn)行10倍梯度稀釋，以各濃度梯度的質(zhì)粒作為模板，取1 μL進(jìn)行PCR檢測，驗(yàn)證該方法的敏感性。

1.11 臨床樣品檢測試驗(yàn)

應(yīng)用本研究建立的羅非魚羅湖病毒的RT-PCR檢測方法，對(duì)來自海南、廣東、云南、福建、廣西、江蘇、天津等地的332份臨床樣品進(jìn)行檢測，將檢出的陽性樣本RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因（廣州）科技股份有限公司進(jìn)行測序，進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性和特異性。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測方法的建立

利用臨床收集的羅非魚羅湖病毒陽性材料，設(shè)計(jì)合成特異性檢測引物，建立針對(duì)羅非魚羅湖病毒的RT-PCR檢測方法，該方法可從羅非魚羅湖病毒陽性材料中擴(kuò)增出片段長度與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的目的條帶（圖1）。

M：DNA分子標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1：陰性對(duì)照；2：擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 陽性重組質(zhì)粒的構(gòu)建

陽性目的條帶經(jīng)純化回收，與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)篩選培養(yǎng)增菌后，用小量質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，將此陽性克隆通過正反兩端2次測序獲得499 bp的序列，與GenBank中發(fā)布的羅非魚羅湖病毒基因序列（GenBank登錄號(hào)：KU751816）的同源性為99.6%。

2.3 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化

比較不同濃度的引物、不同的模板濃度以及不同的退火溫度條件下PCR結(jié)果（圖2），確定反應(yīng)體系為：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，滅菌ddH2O 7 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，共30次循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃下保存。

2.4 RT-PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)自然感染羅湖病毒發(fā)病的羅非魚、健康羅非魚、野生羅非魚、KHV、CyHV-2、RSIV、ISKNV、GCRV、SVCV、NNV的DNA和cDNA的擴(kuò)增結(jié)果顯示，僅自然感染TiLV發(fā)病的羅非魚擴(kuò)增出499 bp的特異性目的條帶，而野生羅非魚、健康羅非魚及其他對(duì)照組均未擴(kuò)增出任何條帶（圖3），表明該方法有較強(qiáng)的特異性。

M：DL2000 DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；1-8：引物用量分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 μL；9-16：模板用量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL ；17-24：退火溫度設(shè)為45.0、46.2、48.9、52.7、57.6、61.6、63.8、65.0 ℃

M：DNA分子標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1：自然感染TiLV發(fā)病羅非魚；2：健康羅非魚；3：野生羅非魚；4：KHV；5：CyHV-2；6：RSIV；7：ISKNV；8：GCRV；9：SVCV；10：VNNV

2.5 RT-PCR敏感性擴(kuò)增結(jié)果

將原始濃度為1 ng/mL的重組質(zhì)粒DNA稀釋10-5倍時(shí)，仍可擴(kuò)增出清晰的目的條帶，即該P(yáng)CR檢測方法最低能檢出10 fg/mL的pMD19-TiLV質(zhì)粒模板（圖4）。

M：DNA 分子標(biāo)準(zhǔn)；1-7：1 ng/mL, 100 pg/mL, 10 pg/mL, 1 pg/mL, 100 fg/mL, 10 fg/mL, 1 fg/mL 的pMD19-TiLV質(zhì)粒

2.6 臨床樣品的檢測和測序分析

應(yīng)用建立的羅非魚羅湖病毒RT-PCR檢測方法對(duì)332份臨床樣品進(jìn)行檢測，檢出36份羅湖病毒陽性樣品（表1），經(jīng)序列測定、比對(duì)，從自然發(fā)病羅非魚陽性材料中擴(kuò)增的目的條帶基因序列與GenBank中羅湖病毒的基因序列同源性高達(dá)99.6%，進(jìn)一步證實(shí)該檢測方法的準(zhǔn)確性和特異性。

表1 不同地區(qū)臨床羅非魚樣品TiLV的RT-PCR檢測結(jié)果

3 討論

羅非魚為聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）向全世界推廣養(yǎng)殖的優(yōu)良魚種之一，其養(yǎng)殖已遍布多個(gè)國家和地區(qū)[9]。我國羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量自2000年一直占世界羅非魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量的50%以上[10]。近年來，隨著我國羅非魚養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大，各種傳染性疾病呈現(xiàn)不斷增長的趨勢，危害羅非魚的主要傳染病有鏈球菌病[11-13]、細(xì)菌性敗血癥等[14-17]。2016年，Eran等[18]報(bào)道一種新型的致命病毒——羅湖病毒造成以色列、厄瓜多爾、埃及等國的養(yǎng)殖羅非魚大面積死亡。

本研究建立針對(duì)TiLV假定蛋白基因segment 3的RT-PCR檢測方法。最低檢出限為10 fg/mL重組質(zhì)粒DNA，說明建立檢測方法有較高的敏感性。

本研究方法僅對(duì)自然感染羅湖病毒發(fā)病的羅非魚檢測出羅湖病毒，而對(duì)健康羅非魚、野生羅非魚、KHV、CyHV-2、RSIV、ISKNV、GCRV、SVCV、NNV均未檢出，說明所建立的RT-PCR檢測方法有很高的特異性。

目前對(duì)于TiLV的檢測，未見其他有效方法，Dong等[8]和Kembou等[19]建立了TiLV的巢式PCR檢測法，但該方法檢測步驟繁瑣，耗時(shí)長，不利于臨床樣品快速檢測要求。本研究建立的TiLV的RT-PCR檢測方法，可以特異、快速地檢測臨床樣品，可在3 h內(nèi)完成檢測，且可對(duì)大量樣品進(jìn)行檢測，這對(duì)羅湖病毒的早期診斷以及大量臨床樣品的檢測有重要意義。

綜上，本研究建立的羅非魚羅湖病毒RT-PCR檢測方法在對(duì)羅非魚樣品進(jìn)行檢測時(shí)有較強(qiáng)的特異性和較高的敏感性，可快速地對(duì)大量臨床樣品進(jìn)行檢測，適用于臨床樣本的批量檢測和羅湖病毒的流行病學(xué)監(jiān)測。

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Development and Application of a RT-PCR Assay of Tilapia Lake Virus

LEI Yan1,2, XIAO Yang1,2, ZHAO Zhen-feng1,2, TANG Shao-lin1,2, LI Jian-bin3, CHEN Fu-yan3

（1.,510515,; 2.,510515,; 3.,,530021,）

【】To establish a method for rapidly detecting tilapia lake virus (TiLV) byRT-PCR. 【】A pair of specific primers were designed according to the complete genome hypothetical protein segment 3 of a novel RNA virus, called TiLV, and RNA of TiLV was extracted and reversely transcribed to cDNA as template for PCR. A rapid RT-PCR method was established for detection ofTiLV by optimization of the reaction parametersAnd the Tilapia whichnaturally infected with TiLV was detected by the RT-PCR method. 【】The specific band of 499 bp was amplified from the positive sample, but no specific band was found from healthy tilapia, wild tilapia and other control. Sequencing analysis indicated that this method was accurate, and 10 fg/mL DNA plasmid of the TiLV could be detected. 332 clinical samples were collected and 36 of those were positive, and the detection result was verified by sequencing and sequence alignment.【】 The findings indicated that the RT-PCR assay could be used for the detection of TiLV. The established RT-PCR assay could lay the foundation for the detection and epidemiological investigation of TiLV infection.

Tilapia; Tilapia Lake Virus; rapid detection; RT-PCR

S943.125.41

A

1673-9159（2019）03-0001-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.03.001

2017-06-27

廣西科技重大專項(xiàng)（桂科AA17204081-5）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣西創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)資金（nycytxgxcxtd-08-02）

雷燕（1983—），男，碩士，研究方向?yàn)轲B(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物病害防治。E-mail: leikunnuy@163.com

陳福艷（1979—），女，副研究員，研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物病害與防治。E-mail: 215174469@qq.com

雷燕，肖洋，趙振峰，等. 羅非魚羅湖病毒RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 39(3): 1-5.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）