線粒體抗氧化對神經(jīng)病理性疼痛大鼠TRPV1表達(dá)的影響

孫玉紅，李 銳，張 野

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain, NP)是損傷或疾病累及包括外周和中樞水平在內(nèi)的軀體感覺系統(tǒng)的結(jié)果。 NP兩種主要突出特征是痛覺過敏和自發(fā)疼痛。NP起因廣泛,病理生理機(jī)制復(fù)雜,常規(guī)阿片類藥物或非甾體抗炎藥治療效果均不理想[1]。前期研究[2]顯示線粒體靶向抗氧化劑能有效緩解大鼠的疼痛行為,與減輕氧化應(yīng)激水平,改善線粒體功能有關(guān),但具體機(jī)制仍不明確。瞬時感受器電位香草酸受體1(transient receptor potential cation channel,subfamily V, member 1，TRPV1)是瞬時感受器電位(transient receptor potential, TRP)超家族成員之一,主要表達(dá)在初級傳入感覺神經(jīng)元上,與痛覺傳遞與調(diào)制密切相關(guān)。激活的TRPV1可以介導(dǎo)P物質(zhì)等釋放產(chǎn)生痛覺[3]。該研究擬探討線粒體抗氧化對 NP大鼠疼痛行為及TRPV1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、儀器和試劑清潔級雄性SD大鼠120只,6～8周齡,體質(zhì)量200～230 g,由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。von-Frey觸痛儀購自美國IITC公司；熱痛刺激儀(BME-410A)購自北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所；三苯基磷陽離子結(jié)合抗氧化劑 (mito-tempo，MT，sc-221945A)購自美國Santa Cruz公司，-20 ℃冰箱保存，使用生理鹽水稀釋成所需濃度；TRPV1一抗購自臺灣Abnova公司；β-actin一抗、山羊抗鼠IgG二抗購自美國Abcam公司。

1.2 NP模型的建立參考Bennett et al[4]的方法制備左側(cè)后肢慢性坐骨神經(jīng)損傷(chronic constriction injury,CCI)模型。大鼠稱重后,采用腹腔給藥戊巴比妥鈉(40～50 mg/kg)麻醉。麻醉起效后, 在股骨下方約1 cm平行于股骨切開皮膚,用小剝離子經(jīng)股二頭肌間隙鈍性分離肌肉,暴露坐骨神經(jīng),用神經(jīng)剝離子輕柔將坐骨神經(jīng)與周圍軟組織分離;在坐骨神經(jīng)分成三支前的主干部位游離神經(jīng)7 mm左右,在距神經(jīng)起始處(三支分叉處)上方2 mm用4-0含鉻羊腸線結(jié)扎坐骨神經(jīng)4道,每道間隔約1 mm,使被結(jié)扎的神經(jīng)長4～5 mm。注意結(jié)扎的松緊度,以打結(jié)時可見肌肉輕微抽動為準(zhǔn);局部生理鹽水沖洗,間斷縫合肌肉筋膜、皮下組織以及皮膚。假手術(shù)組(Sham組)除不結(jié)扎坐骨神經(jīng)外,其余同模型組。剔除運(yùn)動障礙或機(jī)械和熱刺激無反應(yīng)的大鼠。

1.3 實驗分組與動物處理所有大鼠飼養(yǎng)在溫度、濕度、燈光受調(diào)控的房間，食物和水充足。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組(n=40)：假手術(shù)組(Sham組)、神經(jīng)病理性疼痛組(NP組)和抗氧化治療組(MT組),每組再根據(jù)時間點(diǎn)細(xì)分為術(shù)前、術(shù)后3、7、14、21 d, 每組8只大鼠。Sham組和NP組分別于術(shù)后7～21 d腹腔注射生理鹽水1 ml； MT組于術(shù)后7～21 d時腹腔注射三苯基磷陽離子結(jié)合抗氧化劑(mito-tempo,MT)0.7 mg/kg(溶于1 ml生理鹽水)。

1.4 疼痛行為學(xué)檢測

1.4.1機(jī)械縮足閾值(mechanical paw withdrawal threshold,MWT)的測定 有機(jī)玻璃籠(20 cm×20 cm×40 cm)置于金屬篩網(wǎng)上,大鼠在其中適應(yīng)環(huán)境15 min,用von-Frey觸痛儀垂直刺激大鼠術(shù)側(cè)足底中部,每足刺激6次,間隔10 s。大鼠會突然縮足或舔足動作視為陽性反應(yīng),記錄電子Von Frey讀數(shù),將6次讀數(shù)平均值計為MWT,評價機(jī)械痛敏。

1.4.2熱縮足潛伏期(thermal paw withdrawal latency,TWL)的測定 在安靜的環(huán)境中,將大鼠單獨(dú)放置于20 cm×20 cm×40 cm大小有機(jī)玻璃籠內(nèi),籠底為厚0.2 mm玻璃,光源自動切斷時間為20 s,以防止足底燙傷。待大鼠適應(yīng)環(huán)境15 min后,光輻射熱照射足底表面,每足照射3次,間隔5～10 min, 20 s內(nèi)縮足視為陽性,記錄從照射到縮足的時間,3次時間的平均值即為TWL,評價熱痛敏。

1.5 脊髓TRPV1表達(dá)的測定采用Western blot法進(jìn)行測定。每組行為學(xué)結(jié)束后隨機(jī)處死3只大鼠,取L4-6節(jié)段脊髓組織,加入RIPA裂解液于冰上勻漿，4 ℃、12 000 r/min 離心30 min,取上清液,采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)丙烯酰胺凝膠電泳后,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用8%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，加入TRPV1一抗(1 ∶500)，β-actin一抗(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST液漂洗10 min×3次,山羊抗鼠IgG二抗(1 ∶10 000),TBST液漂洗10 min×3次，洗膜后ECL顯色,隨后暗室曝光。采用Image J軟件進(jìn)行分析。以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的百分比反映目的蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 線粒體抗氧化對大鼠機(jī)械觸痛的影響與Sham組比較，NP組術(shù)后第3、7、14、21天MWT明顯降低(F=46.47，P<0.05)；MT組術(shù)后第3、7天 MWT明顯降低(F=30.49,P<0.05)；與NP組比較，MT組術(shù)后第14、21天MWT明顯升高(F=39.6，P<0.05)。見圖1A。

2.2 線粒體抗氧化對大鼠熱觸痛的影響與Sham組比較,NP組術(shù)后第3、7、14、21天TWL明顯降低(F=68.87，P<0.05)；MT組術(shù)后第3、7天 TWL明顯降低(F=27.98，P<0.05)；與NP組比較，MT組術(shù)后第14、21天 TWL明顯升高(F=48.56，P<0.05)。見圖1B。

2.3 線粒體抗氧化對TRPV1表達(dá)的影響與Sham組比較,NP組脊髓組織L4-6節(jié)段術(shù)后第7、14、21天時TRPV1表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05),且于術(shù)后第14天達(dá)峰值；MT組TRPV1表達(dá)在術(shù)后第7天時達(dá)峰值；與NP組比較,MT組TRPV1表達(dá)在術(shù)后第14、21天明顯降低(P<0.05),術(shù)后第3、7天差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

3 討論

NP有機(jī)械觸痛、熱觸痛等明顯特征。一旦外周神經(jīng)受損,一系列病理生理改變將會產(chǎn)生。本研究通過制造大鼠CCI模型,行為學(xué)測試表明機(jī)械觸痛及熱觸痛閾值明顯降低,表明NP模型建立成功。

線粒體是自由基的主要來源,也是自由基攻擊的目標(biāo),神經(jīng)損傷后自由基過度產(chǎn)生可引起線粒體氧化應(yīng)激、結(jié)構(gòu)和功能異常,導(dǎo)致線粒體能量產(chǎn)生障礙。線粒體靶向抗氧化劑可以被線粒體有效攝取,緩解線粒體氧化應(yīng)激[5]。前期研究[2]顯示,與對照組相比,慢性坐骨神經(jīng)性疼痛大鼠脊髓線粒體融合相關(guān)蛋白視神經(jīng)萎縮蛋白1、線粒體融合蛋白1表達(dá)明顯降低,分裂相關(guān)蛋白線粒體動力相關(guān)蛋白、分裂蛋白表達(dá)明顯升高,線粒體抗氧化治療后,線粒體分裂融合相關(guān)蛋白表達(dá)與對照組比較無明顯差異。參照文獻(xiàn)[6],大鼠NP建立后每天腹腔注射0.7 mg/kg的MT，實驗結(jié)果也證實抗氧化治療能明顯改善NP大鼠的疼痛閾值。線粒體抗氧化治療可以逆轉(zhuǎn)慢性坐骨神經(jīng)痛大鼠脊髓TRPV1表達(dá)的上調(diào)。這些結(jié)果提示MT可能通過抑制脊髓TRPV1的表達(dá)來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

表1 三組大鼠脊髓TRPV1表達(dá)水平的比較

與Sham組比較:*P<0.05； 與NP組比較:#P<0.05

圖1 3組大鼠各時間點(diǎn)機(jī)械觸痛及熱觸痛

A:3組大鼠各時間點(diǎn)機(jī)械觸痛；B:3組大鼠各時間點(diǎn)熱觸痛；與Sham組比較：*P<0.05；與NP組比較：#P<0.05

TRPV1作為一種非選擇性離子通道,可能被大量生理或化學(xué)刺激激發(fā)。有報道[7]稱TRPV1在神經(jīng)元上表達(dá)可能導(dǎo)致神經(jīng)病變。很多研究[8-9]證實TRP通道涉及紫杉醇或奧沙利鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛。長春新堿抗腫瘤治療不可避免地會引起外周神經(jīng)病變,研究[7]顯示長春新堿誘導(dǎo)的NP大鼠小背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元上TRPV1表達(dá)會明顯增加。TRPV1表達(dá)可能導(dǎo)致長春新堿誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛的發(fā)生發(fā)展。本實驗也顯示NP大鼠脊髓TRPV1表達(dá)有明顯增加；抗氧化治療后,TRPV1表達(dá)明顯下降,說明TRPV1可能參與慢性坐骨神經(jīng)痛的發(fā)展。

線粒體抗氧化治療減輕NP的具體機(jī)制尚未明確。前期研究[2]表明線粒體抗氧化治療能降低NP大鼠氧化應(yīng)激水平,改善線粒體功能。其他抗氧化劑如迷迭香酸，可通過抑制腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、凋亡因子來減輕慢性坐骨神經(jīng)痛大鼠的疼痛閾值[10]。也有研究[11]報道炎癥因子TNF可使TRPV1表達(dá)上調(diào)產(chǎn)生疼痛,予以抗TNF生物制劑可明顯緩解疼痛。本研究表明NP大鼠線粒體靶向抗氧化治療后,TRPV1表達(dá)明顯下調(diào)。線粒體抗氧化治療是否通過緩解氧化應(yīng)激,減輕炎癥反應(yīng)來調(diào)節(jié)TRPV1的表達(dá)還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述,線粒體抗氧化能明顯降低慢性坐骨神經(jīng)損傷大鼠的疼痛行為；NP的發(fā)生發(fā)展與TRPV1表達(dá)明顯增加有關(guān),線粒體抗氧化治療能降低TRPV1表達(dá),可能成為NP治療的新靶點(diǎn)。