結直腸癌中RAC3表達水平及其對FOLFOX方案療效的影響

方昌義，昝建寶，苗 祥，鄒兵兵，姜朋朋，余昌俊

近年來，我國結直腸癌(colorectal cancer，CRC)的發(fā)病率逐年升高，且呈現(xiàn)趨向年輕化的態(tài)勢。其中，在城市地區(qū)惡性腫瘤的發(fā)病率位列第二，在農村地區(qū)位列第五，年死亡率為10.25/10萬人[1]，發(fā)病及死亡絕對例數(shù)均高居世界第一。目前CRC的外科治療理念和手段包括：開腹、腹腔鏡、機器人D3 CRC根治術，全直腸系膜切除術、結腸完整系膜切除術等均較為成熟并廣泛開展，但事實證明，單純依靠提高手術技術手段并不能明顯改善CRC患者的預后。以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)為基礎藥物聯(lián)合奧沙利鉑(oxaliplatin, L-OHP)的藥物化療已成為Ⅲ期及部分Ⅱ 期CRC患者的標準治療方案[2-3]，但部分患者對亞葉酸鈣聯(lián)合5-FU、奧沙利鉑(folic acid-5-fluorouracil and oxaliplatin，F(xiàn)OLFOX)化療方案反應不佳，總體有效率僅有50%左右[4]。因此，篩選出對FOLFOX化療方案不敏感的CRC患者，將是提高CRC患者化療療效的良好策略，也是CRC精準治療的重要一環(huán)。研究[5]顯示受體相關共激酶3(receptor associated-coactivator 3，RAC3)來源于CRC患者異常擴增的染色體區(qū)域20 q，并與多種CRC細胞對5-FU及L-OHP的耐藥有關。該研究擬通過實驗檢測RAC3在CRC組織中的表達水平并驗證其表達水平與CRC患者對FOLFOX方案敏感度的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 所選48例CRC組織標本來自2016年8月～2017年9月間在安徽醫(yī)科大學附屬安慶醫(yī)院接受首次CRC根治手術的患者，CRC診斷有明確的病理組織學證據(jù)。所有入選患者術前未接受局部或全身的包括化療、放療及免疫治療等在內的任何形式的抗腫瘤治療。所有標本離體后30 min內進行樣本取材并放入液氮貯存，取材范圍包括腫瘤組織和相對應的距腫瘤邊緣5～10 cm以上的正常黏膜上皮組織。所有入選組織標本具有完整的術后病理資料。同時收集到安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院及附屬安慶醫(yī)院病理科2014年3月～2017年4月經結腸鏡或直腸鏡活檢并獲得病理證實為結/直腸癌125例石蠟包埋組織標本，入選患者初次評估無法手術切除且術前行FOLFOX方案化療2～3個月，且在化療后1個月內行影像學檢查并根據(jù)實體腫瘤客觀療效評定標準進行臨床療效評價，排除術前行新輔助放化療患者。

1.1.2入選病例一般情況 48例CRC患者中，男26例，女22例；年齡40～81歲，中位年齡63歲。術后病理分期按照第七版美國癌癥聯(lián)合委員會聯(lián)合修訂的標準:Ⅰ期3例，Ⅱ期29例，Ⅲ期12例，Ⅳ期4例；病理學類型:高分化15例,中分化19例,低分化14例。125例石蠟標本中，來源于男性患者65例，女性60例，年齡44～75歲，中位年齡63歲，其中遠處轉移者76例(肝臟轉移43例，其中單發(fā)轉移灶31例，多發(fā)轉移灶12例；骨轉移19例，其中恥骨聯(lián)合/髂關節(jié)轉移8例，椎骨及骶前轉移11例；腹膜后淋巴結及大網(wǎng)膜轉移14例)、局部病灶浸潤固定無法根治性切除者37例(前列腺/精囊腺/膀胱/附件侵犯23例，髂血管旁淋巴結侵犯9例，側腹壁浸潤固定5例)。超低位直腸癌(距肛緣≤3 cm)極力要求保肛者12例。

1.1.3主要試劑及儀器 RNA提取試劑 RNAisoTMPlus、逆轉錄試劑及熒光定量試劑盒SYBR Premix ExTaqⅡ購自大連TaKaRa Bio公司；兔抗人 RAC3 單抗購自美國 Santa Cruz生物技術公司。酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國Thermo scientific公司；實時熒光定量 PCR儀(Light Cycler? 480 System)購自上海羅氏公司；抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒購自上?；蚩萍加邢薰?。

1.2 方法

1.2.1實時熒光定量PCR 根據(jù)逆轉錄及熒光定量試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR。PCR引物序列見表1。在Light Cycler? 480 System實時熒光定量PCR儀上進行兩步法PCR，反應條件見表2。

表1 RAC3實時熒光定量PCR引物序列信息

表2 CRC組織標本RAC3實時熒光定量PCR反應參數(shù)

1.2.2免疫組化 免疫組化石蠟切片經脫蠟水化、高壓抗原修復后按照說明書進行免疫組化染色。顯微鏡下檢測組織切片中 RAC3 的蛋白表達情況。對染色強度進行評分：0 分(未染色)、1 分(淡黃色弱染色)、2 分(棕黃色中度染色)、3 分(棕褐色強染色)。對染色面積進行打分：0 分(<10%)、1 分(10%～ 25%)、2 分(25%～ 50%)、3 分50%～ 75%)、4 分(>75%)。染色總得分 = 染色強度得分×染色面積得分。染色總得分≤3 分定義為陰性，3分<總得分≤6 分為弱陽性，>6 分為強陽性。

1.3 統(tǒng)計學處理采用 SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，student’t檢驗用于比較CRC組織與癌旁正常組織中的RAC3表達水平差異，χ2檢驗用于比較CRC組織中RAC3的相對表達水平與術后臨床病理指標之間的關系。Kaplan-Meier生存分析及Log-rank檢驗用于比較不同RAC3表達水平患者的預后差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CRC組織中RAC3的表達水平及其與臨床病理特征之間的關系qRT-PCR結果顯示CRC組織中RAC3水平明顯高于癌旁正常黏膜上皮組織 (數(shù)據(jù)以ΔCt顯示，P<0.01)，見圖1。并且分析結果顯示RAC3表達水平與腫瘤較晚分期(P=0.041)、微血管侵犯(P=0.014)、淋巴結轉移(P=0.030)相關，見表3，提示RAC3可能與CRC患者預后有關。隨后分析癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)公共數(shù)據(jù)庫中597例CRC(低表達組患者298例，高表達組患者299例)患者的總生存數(shù)據(jù)，Kaplan-Meier生存分析顯示RAC3表達增高的CRC患者術后總體生存期(overall survival，OS)縮短(P<0.01)，見圖2。

圖1 RAC3在結腸癌組織及癌旁正常結腸黏膜組織中表達水平

與正常結腸黏膜比較：**P<0.01

表3 CRC組織中RAC3的表達水平與不同臨床病理特征之間的關系

圖2 Kaplan-Meier 生存曲線顯示TCGA數(shù)據(jù)庫中不同RAC3表達水平的 CRC患者的OS

2.2 CRC組織中RAC3的蛋白表達水平及其與FOLFOX化療方案臨床療效之間的關系RAC3抗體免疫組化染色后，陽性信號(棕褐色顆粒)，主要在細胞質中表達。結果顯示CRC組織中RAC3高表達，正常結直腸黏膜上皮組織RAC3不表達或弱表達，見圖3。隨后根據(jù)RAC3蛋白在CRC組織中的表達水平分為陰性和陽性兩組，并分析其與患者對FOLFOX 化療方案敏感性之間的關系。結果顯示RAC3陽性表達患者對FOLFOX 化療反應較差(P<0.05)。見表4。

圖3 免疫組化分析 RAC3 在正常結腸黏膜

項目nCRPRSDPDCR+PR陽性715(7.04)26(36.62)29(40.85)11(15.49)31(43.66)陰性547(12.96)30(55.56)14(25.92)3(5.56)37(68.52)χ2值7.639P值<0.05

CR：完全緩解；PR：部分緩解；SD：疾病穩(wěn)定；PD：疾病進展

3 討論

CRC已成為我國居民健康的嚴重威脅和醫(yī)療衛(wèi)生的重大負擔。雖然CRC的綜合診療逐漸規(guī)范、臨床療效提高，但CRC患者的總體預后仍較差，五年標準化生存低于歐美等發(fā)達國家10個百分點左右[6]。自20世紀90年代開始，輔助化療進入臨床實踐，代表性藥物如5-FU等能在一定程度上改善CRC患者的總體預后，由此進入了根治性手術與輔助化療相結合的綜合治療的時代。但化療耐藥事件在臨床上時有發(fā)生，部分患者對化療反應不敏感，最終導致腫瘤復發(fā)或轉移，嚴重影響預后。CRC化療耐藥的出現(xiàn)，與多種潛在的關鍵調控分子及信號通路的激活有關。因此，針對驅動化療耐藥的關鍵基因開展研究，將是加快化療耐藥基礎及臨床研究進展、提高CRC患者化療療效的良好策略，也是CRC綜合治療精準化和個體化的重要內涵。

RAC3來源于CRC患者異常擴增的染色體區(qū)域20q，同時也是影響包括乳腺癌在內的多種腫瘤患者預后的重要因素[7-8]。在中國人群中，約35%的CRC樣本出現(xiàn)RAC3過表達且影響腫瘤的進程[9]。新近研究顯示結腸癌中RAC3過表達與包括HCT116在內的多種CRC細胞對5-FU及L-OHP的耐藥有關[5]，其可能的機制涉及抗自噬作用以及核因子kappa-B(nuclear factor kappa-B，NF-κB)分子的激活等[10]。由此，RAC3可能是篩選對FOLFOX 化療反應不敏感的CRC患者亞群的潛在標志物[11]。

本研究顯示，RAC3在CRC組織中的表達明顯高于癌旁正常結腸黏膜上皮組織，免疫組化結果亦顯示RAC3蛋白陽性表達率在CRC組織中較高，差異有統(tǒng)計學意義。通過分析CRC組織標本的臨床病理資料表明，RAC3的表達水平在有淋巴結轉移及較晚臨床分期患者中較高，與Xie et al[12]等研究結果相一致。同時本研究還表明有微血管侵犯的CRC組織標本中RAC3水平亦顯著增高，這些結果表明RAC3過表達與CRC的進程相關，可能影響患者預后。TCGA公共數(shù)據(jù)庫中597例CRC患者的Kaplan-Meier 生存分析顯示 RAC3表達增高的CRC患者術后5年生存率為56%，而RAC3低表達的患者術后5年生存率為64%。隨后依據(jù)RAC3蛋白是否表達對經腸鏡活檢CRC標本進行分組，并分析亞組患者對FOLFOX方案化療的敏感度。結果顯示RAC3陽性表達組患者的CR+PR率只有43.66%(31/71)，明顯低于RAC3陰性表達組患者68.52%(37/54)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以上結果表明RAC3在CRC組織中高表達與患者惡性病理特征有關，提示患者預后不良；該患者亞群對FOLFOX 化療方案的敏感度較低，可能需要包括多學科協(xié)作在內的更加精準的個體化綜合治療以及更加精細的術后管理和監(jiān)測。

綜上所述，本研究揭示RAC3可能參與CRC的發(fā)展進程，并與患者對FOLFOX化療方案的臨床反應有關。RAC3可能是CRC精準治療策略中一個潛在的生物標志物。