PGE2/PGE2-R介導(dǎo)的RAS/ERK及PI3K/AKT信號(hào)途徑與子宮肌瘤發(fā)病機(jī)制的研究

柯小平， 李經(jīng)維,2 ，李 莉,2 ，劉茗敏

前列腺素是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，PGE2(prostaglandin E2)是環(huán)氧合酶促進(jìn)花生四烯酸代謝所形成的產(chǎn)物[1]。PGE2受體分為EP1、EP2、EP3和EP4四種亞型，介導(dǎo)不同的PGE2依賴性生物學(xué)效應(yīng)[2]。PGE2可與跨膜G蛋白偶聯(lián)的受體EPs相互作用，并激活或阻斷胞內(nèi)第二信使。研究[3]證實(shí)，子宮肌肉中會(huì)有EP1受體的表達(dá)，通過(guò)提高胞內(nèi)鈣離子濃度和激活蛋白激酶C而發(fā)揮作用。研究[4]表明，子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展與多種生長(zhǎng)因子有關(guān)，其中包括表皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)和血小板生長(zhǎng)因子等，這些生長(zhǎng)因子會(huì)促進(jìn)肌瘤細(xì)胞的有絲分裂及生長(zhǎng)，其中IGF-1具有刺激子宮肌層增生功能的調(diào)節(jié)因子?；罨疓蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一步，其中最主要的信號(hào)通路為PI3K/AKT和Ras-Raf-ERK信號(hào)通路[5]。在PI3K/AKT信號(hào)通路中，磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使[6]。絲/蘇氨酸蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)是PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個(gè)重要的下游靶激酶。PI3K/AKT信號(hào)通路參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化信號(hào)調(diào)節(jié)[7]。在Ras-Raf-ERK信號(hào)通路中，生長(zhǎng)因子與受體結(jié)合后激活酪氨酸激酶并傳遞給Ras蛋白，Ras-GTP直接與Raf相結(jié)合激活[8]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)包括ERK1和ERK2，與細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)[9]。RAS/ERK及PI3K/AKT信號(hào)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)，參與調(diào)控細(xì)胞周期啟動(dòng)、增殖或凋亡效應(yīng)[10]。

該研究旨在探究PGE2及其受體介導(dǎo)的RAS/ERK和PI3K/AKT兩條細(xì)胞增殖信號(hào)途徑在子宮肌瘤發(fā)病機(jī)制方面的作用。收集子宮肌瘤和其鄰近正常平滑肌組織，Real-time PCR檢測(cè)PEG2-R(EP1)的表達(dá)，Western blot檢測(cè)PGE2和PGE2-R的表達(dá)；經(jīng)PGE2-R激動(dòng)劑或抑制劑預(yù)處理的子宮肌瘤細(xì)胞后，測(cè)定細(xì)胞的增殖效應(yīng)，并采用Real-time PCR及Western blot檢測(cè)PGE2/PGE2-R介導(dǎo)的RAS/ERK途徑中和PI3K/AKT途徑信號(hào)分子Ras、ERK、PI3k、AKT、IGF-1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)及增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)等指標(biāo)。探究PGE2/PGE2R介導(dǎo)的子宮肌瘤增殖信號(hào)及增殖效應(yīng)，為子發(fā)病機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例資料選擇2014年1月～2015年1月同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院收治的腹腔鏡下行子宮肌瘤切除術(shù)的30例患者，年齡30～52(40.66±5.78)歲，近6個(gè)月內(nèi)未服用激素類(lèi)藥物。子宮肌瘤和平滑肌經(jīng)病理學(xué)確診，無(wú)其他并發(fā)癥。選取手術(shù)切除的肌瘤組織為實(shí)驗(yàn)組，肌瘤附近0.5 cm的子宮平滑肌組織(視為健康組)為對(duì)照組。經(jīng)過(guò)患者同意和本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所收集組織一部分保存于液氮中用于后續(xù)蛋白提取和RNA抽提，另一部分剪成小片，用于細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑CCK-8試劑盒購(gòu)自美國(guó)SAB公司，貨號(hào)CP002；SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，貨號(hào)#K0223；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自立陶宛Fermentas公司，貨號(hào)#K1622；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，貨號(hào)PICPI23223；RIPA組織細(xì)胞快速裂解液購(gòu)自北京Solarbio公司，貨號(hào)R0010；PGE2、PGE2-R(EP1)、PCNA、TGF-β、IGF-1、p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2抗體和二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司。其他試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組及給藥 液氮中子宮肌瘤組織和鄰近平滑肌組織取出，RT-PCR檢測(cè)30對(duì)樣本PGE2-R(EP1)的表達(dá)，Western blot檢測(cè)PGE2和PGE2-R(EP1)的表達(dá)。培養(yǎng)子宮肌瘤原代細(xì)胞，同時(shí)加入PGE2-R(EP1受體)抑制劑sc-51322或激動(dòng)劑17-PT-PGE2，分為原代細(xì)胞組、原代+sc-51322組和原代+17-PT-PGE2組。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) 子宮肌瘤組織置于1%雙抗(青鏈霉素混合液)的HBSS中；0.4%膠原酶8 ml(內(nèi)含DNase I)，37 ℃搖床消化；消化結(jié)束后后用含10%的DMEM-F12重懸細(xì)胞，置細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。每隔20 min將沒(méi)有貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，重復(fù)3次，第1次貼下來(lái)的即為平滑肌細(xì)胞，經(jīng)過(guò)3次貼壁仍未貼壁的細(xì)胞即為平滑肌細(xì)胞。此貼壁法是根據(jù)時(shí)間差采用的對(duì)成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞進(jìn)行的分離。24 h后健康細(xì)胞均已貼壁；48 h后貼壁細(xì)胞形成小的克隆。鑒定子宮平滑肌細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)采用α-actin免疫組化染色，培養(yǎng)子宮肌瘤細(xì)胞同平滑肌細(xì)胞。

1.3.3CCK-8檢測(cè)子宮肌瘤原代細(xì)胞的增殖活性 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的子宮肌瘤原代細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，顯微鏡下計(jì)數(shù)后制成3×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。分別取100 μl至96孔培養(yǎng)板，每組細(xì)胞每塊板接種3個(gè)同樣的孔作為復(fù)孔，3×103個(gè)細(xì)胞/孔，以100 μl培養(yǎng)液做空白對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)分組如下：① 原代細(xì)胞：100 μl完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)；② 原代細(xì)胞+sc-51322：加入終濃度為10 μmol/L sc-51322(PGE2-R抑制劑)；③ 原代細(xì)胞+17-PT-PGE2：加入終濃度為5 μmol/L 17-PT-PGE2 (PGE2-R激動(dòng)劑)。分別在共培養(yǎng)0、24、48、72 h后，按1 ∶10體積比混合細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)和無(wú)血清必需基本培養(yǎng)基，每孔400 μl 加入待測(cè)孔中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h；孵育1 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)吸光度(absorbance,A)值，并記錄每塊板的數(shù)值。

1.3.4Real-time PCR 取子宮肌瘤組織和平滑肌組織各10 mg，TRIzol提取總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄程cDNA。設(shè)計(jì)PGE2-R引物：上游引物：5′-CACCTTCTTTGGCGGCTCTC -3′；下游引物：5′-CGACACCACCATGATACCGA-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度100 bp。以GAPDH為內(nèi)參照，上游引物：5′-AATCCCATCACCATCTTC-3′；下游引物： 5′- AGGCTGTTGTCATACTTC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度218 bp。PCR反應(yīng)總體積25 μl，反應(yīng)程序：95 ℃，10 min(95 ℃，15 s；60 ℃，45 s)×40；95 ℃,15 s；60 ℃,1 min；95 ℃,15 s；60 ℃,15 s。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析(ABI Prism 7300 SDS 軟件)。

1.3.5Western blot實(shí)驗(yàn) 將需要抽提蛋白的細(xì)胞或組織，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液，4 ℃充分裂解細(xì)胞，95 ℃以上加熱10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80 ℃ 冰箱。使用BCA蛋白濃度試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量。

選取5%的濃縮膠和10%的分離膠，取20 μl蛋白樣品進(jìn)行上樣，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。麗春紅染色檢測(cè)轉(zhuǎn)膜成功。使用10%的脫脂乳粉溶液進(jìn)行封閉2 h后，加入稀釋的一抗：PGE2 1 ∶300，PGE2-R 1 ∶500，PCNA 1 ∶1 000，TGF-β 1 ∶300，IGF-1 1 ∶2 000，AKT 1 ∶1 000，p-AKT 1 ∶1 000，p-ERK1/2 1 ∶1 000，ERK1/2 1 ∶1 000，GAPDH 1 ∶2 000。孵育一抗的膜用TBST洗3次，每次15 min，按照1 ∶1 000稀釋標(biāo)記的二抗與膜37 ℃孵育2 h。用TBST洗滌3次，每次5 min。使用化學(xué)發(fā)光法對(duì)蛋白進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)30對(duì)子宮肌瘤患者和健康臨床樣本的PGE2-R(EP1)表達(dá)RT-PCR檢測(cè)30對(duì)子宮肌瘤和子宮平滑肌的結(jié)果顯示，子宮肌瘤組織的PEG2-R(EP1) mRNA的表達(dá)量為(0.004 67±0.001 37)，子宮平滑肌組織的表達(dá)量(0.001 69±0.004 64)。結(jié)果顯示：子宮肌瘤組PGE2-R(EP1)的mRNA表達(dá)量顯著高于子宮平滑肌組(P<0.01)。子宮肌瘤的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致PGE2受體的基因表達(dá)量升高。

2.2 Western blot檢測(cè)4對(duì)樣本PGE2和PGE2-R(EP1)的表達(dá)如圖1和表1所示，Western blot檢測(cè)4對(duì)樣本PGE2和PGE2-R(EP1)的結(jié)果表明，子宮肌瘤組織的PGE2和PGE2-R(EP1)的蛋白表達(dá)量均顯著高于子宮平滑肌組織(P<0.01)，這與基因的檢測(cè)結(jié)果相一致。

2.3 CCK-8檢測(cè)子宮肌瘤原代細(xì)胞的增殖活性如表2所示，CCK8結(jié)果顯示，與原代細(xì)胞組比較，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，原代+sc-51322組中的細(xì)胞增殖顯著受到抑制(P<0.01)，而原代+17-PT-PGE2組中的細(xì)胞的增殖活性顯著增加(P<0.01)，并且在培養(yǎng)72 h后，sc-51322對(duì)細(xì)胞增殖的抑制及17-PT-PGE2對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)均達(dá)到最大值，說(shuō)明子宮肌瘤原代細(xì)胞的增殖與PGE2-R的表達(dá)密切相關(guān)。

圖1 Western blot檢測(cè)4對(duì)樣本PGE2和PGE2-R(EP1)的表達(dá)

1：子宮平滑肌組1；2：子宮平滑肌組2；3：子宮平滑肌組3；4：子宮平滑肌組4；5：子宮肌瘤組1；6：子宮肌瘤組2；7：子宮肌瘤組3；8：子宮肌瘤組4

表1 Western blot檢測(cè)4對(duì)樣本PGE2和PGE2-R(EP1)的表達(dá)

與子宮平滑肌組比較：**P<0.01

2.4 RT-PCR檢測(cè)子宮肌瘤原代細(xì)胞的PCNA、TGF-β、IGF-1基因表達(dá)如表3所示，RT-PCR檢測(cè)PCNA、TGF-β、IGF-1的表達(dá)結(jié)果顯示，原代+sc-51322組中的細(xì)胞PCNA、TGF-β、IGF-1的mRNA表達(dá)量顯著低于原代細(xì)胞組，原代+17-PT-PGE2組中的細(xì)胞PCNA、TGF-β、IGF-1的mRNA表達(dá)量顯著高于原代細(xì)胞組。以上結(jié)果說(shuō)明子宮肌瘤原代細(xì)胞中PCNA、TGF-β、IGF-1的mRNA表達(dá)量受到PGE2-R的調(diào)控，并會(huì)隨著PGE2-R含量的增加而上調(diào)。

2.5 Western blot檢測(cè)子宮肌瘤原代細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)如圖2和表4所示，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白的結(jié)果顯示，原代+sc-51322組中的細(xì)胞PGE2、PGE2-R(EP1)、PCNA、TGF-β、IGF-1、p-AKT和p-ERK1/2的蛋白表達(dá)量均顯著低于原代細(xì)胞組，原代+17-PT-PGE2組中的細(xì)胞PGE2、PGE2-R(EP1)、PCNA、TGF-β、IGF-1、p-AKT和p-ERK1/2的蛋白表達(dá)量均顯著高于原代細(xì)胞組，說(shuō)明子宮肌瘤原代細(xì)胞中RAS/ERK及PI3K/AKT信號(hào)途徑受到PGE2及其受體PGE2-R(EP1)的調(diào)控。

表2 CCK-8檢測(cè)子宮肌瘤原代細(xì)胞的增殖活性

與原代細(xì)胞組比較：*P<0.05，**P<0.01

表3 RT-PCR檢測(cè)子宮肌瘤各組細(xì)胞PCNA、TGF-β、IGF-1基因表達(dá)

與原代細(xì)胞組比較：**P<0.01

圖2 Western blot檢測(cè)子宮肌瘤各組細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)

A：子宮肌瘤原代細(xì)胞；B：原代+sc-51322細(xì)胞；C：原代+17-PT-PGE2細(xì)胞

表4 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中PGE2、PGE2-R(EP1)、PCNA、TGF-β、IGF-1、p-AKT、p-ERK1/2的表達(dá)

與原代細(xì)胞組比較：**P<0.01

3 討論

目前，對(duì)于子宮肌瘤的病因尚不清楚，推測(cè)其可能與卵巢內(nèi)分泌功能、孕激素受體、孕激素、生長(zhǎng)因子等因素相關(guān)[11]。本研究通過(guò)收集子宮肌瘤和正常子宮平滑肌組織，結(jié)果顯示子宮肌瘤的PGE2-R(EP1)的mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均顯著高于正常平滑肌組織(P<0.01)。這說(shuō)明子宮肌瘤的發(fā)病與組織中PGE2和PGE2-R(EP1)的基因和蛋白的含量有關(guān)聯(lián)，推測(cè)組織中PGE2和PGE2-R(EP1)的上調(diào)會(huì)促使子宮肌瘤的發(fā)生與發(fā)展。

研究[12]表明，子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展與多種生長(zhǎng)因子有關(guān)，其中包括TGF-β、IGF-1和PCNA等，這些生長(zhǎng)因子會(huì)促進(jìn)肌瘤細(xì)胞的有絲分裂及生長(zhǎng)，其中IGF-1的促進(jìn)功能最為顯著。本研究以子宮肌瘤原代細(xì)胞為靶細(xì)胞，加入PGE2-R(EP1受體)抑制劑sc-51322或激動(dòng)劑17-PT-PGE2，測(cè)定了細(xì)胞的增殖活性以及PCNA、TGF-β、IGF-1的基因和蛋白表達(dá)情況。本研究中，與原代細(xì)胞組比較，原代+sc-51322組中的細(xì)胞增殖顯著受到抑制(P<0.01)，說(shuō)明抑制劑sc-51322的加入，抑制了PGE2-R(EP1受體)的表達(dá)，從而抑制了子宮肌瘤原代細(xì)胞的增殖活性。同時(shí)，本研究還顯示，原代+17-PT-PGE2組中的細(xì)胞的增殖活性顯著高于原代細(xì)胞組，說(shuō)明激動(dòng)劑17-PT-PGE2的加入激活了PGE2-R(EP1受體)的表達(dá)，從而增強(qiáng)了子宮肌瘤原代細(xì)胞的增殖活性。為了探究PGE2-R(EP1受體)的表達(dá)與相關(guān)生長(zhǎng)因子分泌的關(guān)系，本研究測(cè)定了PCNA、TGF-β、IGF-1的基因及蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，原代+sc-51322組中的細(xì)胞PCNA、TGF-β、IGF-1的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著低于原代細(xì)胞組，而原代+17-PT-PGE2組中的蛋白的表達(dá)量顯著高于原代細(xì)胞組。以上結(jié)果說(shuō)明，子宮肌瘤細(xì)胞中PGE2-R(EP1受體)的表達(dá)與相關(guān)的生長(zhǎng)因子的分泌呈正相關(guān)性。本研究同時(shí)顯示，子宮肌瘤組織中p-AKT和p-ERK1/2均過(guò)度表達(dá)，且p-AKT和p-ERK1/2的表達(dá)與PGE2-R(EP1受體)的調(diào)控密切相關(guān)，證實(shí)PGE2-R(EP1受體)參與了子宮肌瘤的發(fā)生與發(fā)展。

體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PGE2和PGE2-R(EP1)參與調(diào)控了子宮肌瘤的發(fā)生與發(fā)展，并且參與調(diào)控子宮肌瘤原代細(xì)胞中RAS/ERK及PI3K/AKT信號(hào)途徑，為子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制提供了可靠的理論依據(jù)。