鳥苷酸二鈉對Con A 致小鼠免疫性肝損傷保護作用的NF-κB 信號通路機制

韓少偉 李英霞 孫永琦 張玉鎮(zhèn) 李盤欣 金少舉，3

1商丘市第三人民醫(yī)院（河南商丘476000）；2河南省南街村（集團）有限公司（河南臨潁462600）；3漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南省腫瘤發(fā)生與防治創(chuàng)新型科技團隊（河南漯河462002）

肝臟是機體重要的物質(zhì)代謝器官，是體內(nèi)主要的生物轉(zhuǎn)化場所，很多因素如藥物、化學(xué)制劑、毒素、外傷、感染及免疫反應(yīng)等都可能導(dǎo)致肝損傷（liver injury，LH），其受損將直接影響機體的代謝轉(zhuǎn)化和有害物質(zhì)的排泄等［1-2］。我國是肝病特別是病毒性肝炎的高發(fā)區(qū)，目前雖然有許多藥物應(yīng)用于臨床用于治療肝炎等肝損傷疾病，但其治療效果及治愈率仍不理想，大多只能改善癥狀或延緩病情進展［3］。因此，尋找有效且安全的抗肝損傷藥物是目前肝病防治的重要策略和當務(wù)之急。鳥苷酸二鈉（disodium guanylate，GMP-Na2）是鳥苷酸的鈉鹽形式，是常用的食品添加劑和醫(yī)藥原料，具有抗氧化、促生長、調(diào)節(jié)免疫、協(xié)同抗腫瘤、調(diào)節(jié)營養(yǎng)代謝等生理或藥理作用，而關(guān)于其是否有抗免疫性肝損傷的作用尚未見文獻報道［4-6］。本研究采用刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）小鼠尾靜脈注射法復(fù)制免疫性肝損傷動物模型，同時給予鳥苷酸二鈉進行干預(yù)，觀察其抗免疫性肝損傷作用，同時以NFκB 信號通路為研究靶點，探討其肝保護作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物SPF 級ICR 小鼠，4～5 周齡，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，許可證號：SCXK（湘）2016-0002，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。將小鼠飼養(yǎng)于動物房，10 只/籠，調(diào)整室內(nèi)溫度為22～25 ℃，濕度50%～60%，人工12 h/12 h 晝夜周期，自由飲食水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進行實驗。

1.2 藥品與試劑鳥苷酸二鈉，純度≥90%，由河南省南街村集團（有限）公司提供，批號：20160522；刀豆蛋白A（Type A Ⅳ型），100 mg/支，貨號C8110-100 mg，北京索萊寶科技有限公司；聯(lián)苯雙酯滴丸（Bifendate pills），批號160710，北京協(xié)和藥廠；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒、還原性谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）及總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒等，由自南京建成生物工程研究所提供；兔抗IKKβ、IκBα、NF-κB、TNF-α及β-actin 抗體，購自美國Affinity Biosciences 公司；HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG 二抗、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光液、RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、彩色預(yù)染蛋白Marker、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、PVDF 膜、蛋白上樣緩沖液等，購自武漢博士德生物工程有限公司；Beyozol 總RNA 抽提試劑、BeyoRTTMⅢcDNA第一鏈合成試劑盒、Easy-LoadTMPCR Master Mix，由上海碧云天生物技術(shù)有限公司南通分公司提供；PCR 實驗所需引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計合成。

1.3 主要儀器FA1004N 電子分析天平（上海精密儀器儀表有限公司）；752N 紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；H1850R 臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；IMS20 制冰機（河南天馳儀器設(shè)備有限公司）；Olympus BX51-P 顯微鏡（奧林巴斯（中國）有限公司）；Leica RM2235 切片機（德國徠卡）；GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)、電泳槽、轉(zhuǎn)印槽、C1000 Touch PCR 儀、通用型電泳電源（美國伯樂公司）。

1.4 實驗動物分組、造模及給藥將60 只ICR 小鼠隨機分為6 組，分別為正常對照組、模型組（Con A）、陽性對照藥組（聯(lián)苯雙酯200 mg/kg）及鳥苷酸二鈉高、中、低（250、125、62.5 mg/kg）劑量組，每組10 只小鼠，雌雄各半。正常對照組、模型組小鼠灌胃生理鹽水，其它各組灌胃相應(yīng)劑量的藥物，給藥容量均為0.1 mL/10 g 體質(zhì)量，每天1次，連續(xù)給藥7 d。于末次給藥后2 h，除正常對照組尾靜脈注射生理鹽水外，其余各組小鼠均尾靜脈注射Con A（25 mg/kg）進行肝損傷造模，小鼠禁食不禁水。造模24 h 后，取小鼠血清檢測ALT 及AST 活性，取肝左葉組織用于HE 染色病理檢測，取肝右葉部分組織檢測SOD、MDA、GSH-pX 及T-AOC 水平；取肝右葉部分組織采用RT-PCR 及Western Blot 法分析IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α mRNA和蛋白表達水平。

1.5 生化指標的檢測造模后24 h，小鼠摘眼球取血，室溫靜置20 min，4 ℃2 500 r/min離心20 min，收集血清，按照說明書要求檢測ALT 及AST 活性。取小鼠肝右葉組織約100 mg，于冰上充分勻漿，4 ℃3 000 r/min離心20 min，收集上清液，按照試劑盒說明書操作方法測定肝組織SOD、MDA、GSH-Px 及T-AOC 水平。

1.6 肝組織形態(tài)學(xué)觀察小鼠取完血后，立即頸椎脫臼處死，取肝左葉用PBS 沖洗干凈，置于4%多聚甲醛中固定24 h，用梯度乙醇進行脫水，然后依次進行石蠟包埋、切片及HE 染色，于顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化。

1.7 RT-PCR 法檢測肝組織IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α mRNA 表達水平取小鼠肝右葉組織約50 mg，用PBS 沖洗干凈，迅速置入盛有液氮的研缽中充分研磨成粉末狀，移入1.5 mL EP 管中，加入1 mL RNA 抽提試劑，按照試劑盒說明書抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 并進行PCR 實驗。PCR 實驗待測基因引物序列如下：IKKβ上游引物：5′-ACTCCAAAGTCCGGCAGAAG-3′，下游引物：5′-TCACGGGGTATGTGTGAACG-3′，產(chǎn)物288 bp；IκBα上游引物：5′-TCACCTACCAGGGCTACTCC-3′，下游引物：5′-CCTCTGTGAACTCTGACTCCG-3′，產(chǎn)物156 bp；NF-κB 上游引物：5′-CGTGCCCTCTGTCTAAGAGC-3′，下游引物：5′-GCCTCATAGTAGCCATCCCG-3′，產(chǎn)物186 bp；TNF-α上游引物：5′-AACTGTAAGCGGGGCAATCA-3′，下游引物：5′-TGAGGGTCTGGGCCATAGAA-3′，產(chǎn)物127 bp；β-actin上游引物：5′-GTTACAGGAAGTCCCTCACCC-3′，下游引物：5′-CAGACCTGGGCCATTCAGAAA-3′，產(chǎn)物194 bp。

1.8 Western Blot 法檢測肝組織IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α蛋白表達水平取小鼠肝右葉組織約100 mg，用PBS 沖洗干凈，置于勻漿器中，加入1 mL RIPA 蛋白裂解液，于冰上充分勻漿裂解，然后移入1.5 mL EP 管中，4 ℃12 000 r/min 離心20 min，吸取上清即為蛋白提取液，用BCA 法檢測各樣本蛋白濃度并調(diào)整一致，加入等體積Loading buffer（2×），于沸水中煮沸5 min 使蛋白變性，然后每樣取15 μL 進行SDS-PAGE 凝膠電泳，按照Western Bolt 操作流程依次進行轉(zhuǎn)膜、抗原封閉、孵育一抗、孵育二抗及加ECL 顯色液顯影，于凝膠成像儀下拍照成像，讀取各樣本條帶灰度值，以β-actin 為參照分析待測目的蛋白相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計處理。實驗數(shù)據(jù)以（）表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行統(tǒng)計分析，兩組間樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 表示組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鳥苷酸二鈉對Con A 致肝損傷小鼠血清ALT、AST 活性的影響與正常對照組比較，Con A 肝損傷模型組小鼠血清ALT、AST 活性明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，鳥苷酸二鈉250、125 mg/kg 組小鼠血清ALT、AST 活性降低，鳥苷酸二鈉62.5 mg/kg 組小鼠血清AST 活性降低（P＜0.05）。見表1。

表1 鳥苷酸二鈉對Con A 致肝損傷小鼠血清ALT、AST 活性的影響Tab.1 Effects of GMP-Na2 on the activities of ALT and AST in mice with liver injury induced by Con A ±s

表1 鳥苷酸二鈉對Con A 致肝損傷小鼠血清ALT、AST 活性的影響Tab.1 Effects of GMP-Na2 on the activities of ALT and AST in mice with liver injury induced by Con A ±s

注：與正常對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型組聯(lián)苯雙酯鳥苷酸二鈉劑量（mg/kg）——200 250 125 62.5 ALT（U/L）27.04±4.72 88.41±6.29**31.50±3.36##38.33±6.27*##53.82±5.62**##82.81±7.64**AST（U/L）35.24±4.12 81.09±4.15*40.62±6.19##45.69±5.96*#57.93±4.74**##69.35±5.03**##

2.2 鳥苷酸二鈉對Con A 致肝損傷小鼠肝組織SOD、MDA、GSH-Px 及T-AOC 水平的影響與正常對照組比較，Con A 肝損傷模型組小鼠肝組織SOD、GSH-Px 及T-AOC 水平下降，MDA 含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，鳥苷酸二鈉250、125 mg/kg 組小鼠肝組織SOD、GSH-Px 及T-AOC 水平顯著升高，MDA 含量下降（P＜0.05）。見表2。

表2 鳥苷酸二鈉對Con A 致肝損傷小鼠肝組織SOD、MDA、GSH-Px 及T-AOC 水平的影響Tab.2 Effects of GMP-Na2 on the levels of SOD，MDA，GSH-Px，T-AOC in liver tissue of mice with liver injury induced by Con A ±s

表2 鳥苷酸二鈉對Con A 致肝損傷小鼠肝組織SOD、MDA、GSH-Px 及T-AOC 水平的影響Tab.2 Effects of GMP-Na2 on the levels of SOD，MDA，GSH-Px，T-AOC in liver tissue of mice with liver injury induced by Con A ±s

注：與正常對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型組聯(lián)苯雙酯鳥苷酸二鈉劑量（mg/kg）——200 250 125 62.5 SOD（U/mgprot）60.37±4.10 33.68±3.25**56.52±5.17##47.87±4.02**##40.97±4.18**#36.90±3.96**MDA（nmol/mgprot）1.36±0.35 3.72±0.43**1.62±0.25##1.81±0.19*##2.49±0.23**##3.09±0.26**#GSH-Px（U/mgprot）155.94±9.13 105.82±11.96**148.51±7.43##147.10±6.89##135.39±5.62**##118.76±7.69**T-AOC（U/mgprot）4.66±0.42 1.91±0.31**4.27±0.39##4.06±0.48##3.54±0.41**##2.34±0.35**

2.3 鳥苷酸二鈉對Con A 致肝損傷小鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響正常對照組小鼠肝組織鏡下可見肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，肝細胞結(jié)構(gòu)完整，未見變性或壞死；模型組小鼠肝組織鏡下可見肝組織多量大面積變性、壞死或干酪樣變，肝索排列紊亂，肝細胞結(jié)構(gòu)模糊，有大量炎性細胞浸潤；鳥苷酸二鈉250 mg/kg 組小鼠肝組織可見少量炎性細胞浸潤，肝索排列較為整齊，細胞間隙尚可，有少量肝細胞水腫或點狀壞死，但較模型組明顯改善。見圖1。

圖1 鳥苷酸二鈉對Con-A 致肝損傷小鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響（HE 染色，200×）Fig.1 Effects of GMP-Na2 on pathology in liver tissue of mice with liver injury induced by Con-A（HE staining，200×）

2.4 鳥苷酸二鈉對Con A 致肝損傷小鼠肝組織IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α mRNA 表達水平的影響與正常對照組比較，Con A 肝損傷模型組小鼠肝組織IKKβ、NF-κB和TNF-α mRNA 表達水平上調(diào)，IκBα mRNA 表達水平下調(diào)；與模型組比較，鳥苷酸二鈉250 mg/kg 組小鼠肝組織IKKβ、NF-κB和TNF-α mRNA 表達水平下調(diào)，IκBα mRNA 表達水平上調(diào)。見圖2、表3。

圖2 鳥苷酸二鈉對Con-A 致肝損傷小鼠肝組織IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α mRNA 表達水平的影響Fig.2 Effects of GMP-Na2 on the mRNA expression levels of IKKβ,IκBα,NF-κB and TNF-α in liver tissue of mice with liver injury induced by Con-A

2.5 鳥苷酸二鈉對Con A 致肝損傷小鼠肝組織IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α蛋白表達水平的影響與正常對照組比較，Con A 肝損傷模型組小鼠肝組織IKKβ、NF-κB和TNF-α蛋白表達水平升高，IκBα mRNA 表達水平下降；與模型組比較，鳥苷酸二鈉250 mg/kg 組小鼠肝組織IKKβ、NF-κB和TNF-α mRNA 表達水平降低，IκBα mRNA 表達水平增多。見圖3、表4。

圖3 鳥苷酸二鈉對Con-A 致肝損傷小鼠肝組織IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α蛋白表達水平的影響Fig.3 Effects of GMP-Na2 on the protein expression levels of IKKβ,IκBα,NF-κB and TNF-α in liver tissue of mice with liver injury induced by Con-A

表3 鳥苷酸二鈉對Con A 致肝損傷小鼠肝組織IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α mRNA 表達水平的影響Tab.3 Effects of GMP-Na2 on the mRNA expression levels of IKKβ，IκBα，NF-κB and TNF-α in liver tissue of mice with liver injury induced by Con A ±s

表3 鳥苷酸二鈉對Con A 致肝損傷小鼠肝組織IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α mRNA 表達水平的影響Tab.3 Effects of GMP-Na2 on the mRNA expression levels of IKKβ，IκBα，NF-κB and TNF-α in liver tissue of mice with liver injury induced by Con A ±s

注：與正常對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型組鳥苷酸二鈉劑量（mg/kg）--250 IKKβ/β-actin 0.201±0.027 0.595±0.024**0.228±0.020##IκBα/β-actin 0.642±0.043 0.208±0.031**0.349±0.050**##NF-κB/β-actin 0.121±0.023 0.672±0.040**0.451±0.046**##TNF-α/β-actin 0.174±0.029 0.792±0.046**0.397±0.042**##

表4 鳥苷酸二鈉對Con A 致肝損傷小鼠肝組織IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α蛋白表達水平的影響Tab.4 Effects of GMP-Na2 on the protein expression levels of IKKβ，IκBα，NF-κB and TNF-α in liver tissue of mice with liver injury induced by Con A ±s

表4 鳥苷酸二鈉對Con A 致肝損傷小鼠肝組織IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α蛋白表達水平的影響Tab.4 Effects of GMP-Na2 on the protein expression levels of IKKβ，IκBα，NF-κB and TNF-α in liver tissue of mice with liver injury induced by Con A ±s

注：與正常對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型組鳥苷酸二鈉劑量（mg/kg）--250 IKKβ/β-actin 0.223±0.036 0.794±0.035**0.546±0.037**##IκBα/β-actin 0.693±0.043 0.310±0.044**0.518±0.051**##NF-κB/β-actin 0.204±0.032 0.652±0.047**0.457±0.037**##TNF-α/β-actin 0.151±0.013 0.863±0.033**0.508±0.026**##

3 討論

Con A 是一種從刀豆中提取分離而得的植物凝集素，為四聚體球蛋白，影響機體免疫功能，激活T 淋巴細胞，可產(chǎn)生大量炎性細胞因子（包括IL-4、IL-6、TNF-α及IFN-γ等）、趨化因子等，破壞肝細胞完整性，導(dǎo)致肝損傷［7-9］。小鼠尾靜脈注射Con A 復(fù)制的免疫性肝損傷動物模型，與人類病毒性肝炎及自身免疫性肝病發(fā)病過程相似，是篩選和研究肝損傷保護藥的常用動物模型［10-11］。ALT、AST 是肝細胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)氨酶，參與肝代謝的轉(zhuǎn)氨基作用。在生理狀態(tài)下，轉(zhuǎn)氨酶主要存在于肝細胞內(nèi)參與物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化，當肝細胞出現(xiàn)損傷壞死等病理情況時，ALT、AST等轉(zhuǎn)氨酶就會釋放到血液中，導(dǎo)致血清轉(zhuǎn)氨酶增多，故臨床上常通過檢測血清ALT、AST等轉(zhuǎn)氨酶活性來判斷肝功能和肝損傷的嚴重程度［12］。在本研究中，Con A 模型組小鼠血清ALT和AST 活性較正常對照組明顯升高，表明Con A 致小鼠肝損傷模型復(fù)制成功。同時，提前給予鳥苷酸二鈉250、125 mg/kg，可顯著降低肝損傷小鼠血清ALT和AST 活性，并且鳥苷酸二鈉250 mg/kg 可顯著緩解Con A 致肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)形態(tài)變化，提示鳥苷酸二鈉對Con A 致小鼠肝損傷具有一定的保護作用。但關(guān)于鳥苷酸二鈉的肝保護作用的機制尚不清楚，為此作者以氧化應(yīng)激和NF-κB 信號通路為研究對象進行了初步探討。

肝細胞在Con A 誘發(fā)的炎癥因子等刺激下，發(fā)生氧化損傷，產(chǎn)生大量的氧自由基和脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物，破壞肝細胞結(jié)構(gòu)的完整性，引起肝細胞變性或壞死，導(dǎo)致肝損傷和肝臟功能下降［13］。SOD、GSH-Px 是體內(nèi)重要的抗氧化酶，可幫助細胞清除氧自由基和過氧化代謝產(chǎn)物等，其活性大小可反映機體的抗氧化能力；T-AOC 是機體抗氧化能力的總和，亦是評價機體清除氧化代謝產(chǎn)物的重要指標之一；MDA 是脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物，其含量增多必然會加重細胞損傷，導(dǎo)致細胞代謝功能障礙甚至壞死［14-15］。本研究發(fā)現(xiàn)，鳥苷酸二鈉250、125 mg/kg 可顯著增加Con A 致肝損傷小鼠肝組織SOD、GSH-Px 及T-AOC 水平，降低MDA 含量，提示鳥苷酸二鈉可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)防治免疫性肝損傷。

炎癥反應(yīng)是肝損傷的主要表現(xiàn)，Con A 可促使炎癥因子（TNF-α等）的生成和釋放，TNF-α等因子可抑制IKKβ磷酸化，使IKKβ含量增多，但可促進IκBα發(fā)生磷酸化，使得p-IκBα水平增多，IκBα含量下降，促進NF-κB 從IκBα/NF-κB 復(fù)合體上游離出來，游離的NF-κB 可通過核膜進入細胞核內(nèi)，與其相應(yīng)的DNA 反應(yīng)元件結(jié)合，促進炎癥因子TNF-α、IL-1β及IFN-γ等的生成，這些生成的炎癥因子又可反過來激活NF-κB 信號通路，反復(fù)促進炎癥反應(yīng)，進一步加重肝細胞損傷，在此信號通路中NF-κB 是關(guān)鍵因子［16-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，鳥苷酸二鈉250 mg/kg 可下調(diào)Con A 致肝損傷小鼠肝組織IKKβ、NF-κB和TNF-α mRNA和蛋白表達水平，上調(diào)IκBα mRNA和蛋白表達水平，提示鳥苷酸二鈉抗Con A 致小鼠肝損傷與其抑制NF-κB 信號通路有關(guān)。

綜上所述，鳥苷酸二鈉對Con A 致小鼠肝損傷具有較好的防治作用，其作用機制與抗氧化應(yīng)激和抑制NF-κB 信號通路有關(guān)。