特立帕肽通過mTORC2 通路調(diào)控細(xì)胞骨架和黏附斑的觀察研究

陳柏齡 呂中 艾克熱木江·木合熱木 白曉春 鄒學(xué)農(nóng)陳志鵬 林瑋 袁偉權(quán)

1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院脊柱外科（廣州510080）；2廣東省骨科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州510080）；3南方醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院骨科（廣州510050）；4南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系器官衰竭研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州510050）

在臨床骨科診療中，常需要對患者進(jìn)行骨植入物手術(shù)，植入物能否在主體骨中長期穩(wěn)定地固定直接影響著患者的手術(shù)效果和術(shù)后康復(fù)。然而據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后長期松動率高達(dá)70%以上［1］。在骨折內(nèi)鋼板植入內(nèi)固定的患者中，植入物松動失效的發(fā)生率同樣居高不下，因此，近幾十年來，有關(guān)促進(jìn)植入物骨整合的研究一直是熱點(diǎn)。

良好的植入物骨整合是指主體骨與植入物表面之間形成結(jié)構(gòu)性功能聯(lián)結(jié)，兩者間的結(jié)構(gòu)性功能聯(lián)結(jié)緊密而無纖維組織形成。特立帕肽［PTH-（1-34）］做為被人工合成用于臨床治療的甲狀旁腺激素，也是FDA 唯一批準(zhǔn)的用于促進(jìn)骨形成的藥物，目前主要用于骨質(zhì)疏松的研究［2-3］。但新近有臨床病例報(bào)道和少量動物實(shí)驗(yàn)提示，PTH（1-34）還可能促進(jìn)植入物的骨整合。ZATI等［4］報(bào)道1例77歲骨質(zhì)疏松癥患者全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后發(fā)生無菌性松動，在PTH（1-34）（20 μg/d）治療8個(gè)月后，結(jié)果顯示植入物周圍皮質(zhì)骨的厚度顯著增加。JIANG等［5］對20個(gè)月齡的大鼠行植入手術(shù)后，每日注射30 μg/kg的PTH（1-34），持續(xù)5 周，發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)新骨和植入物骨整。ALMAGRO等［6］制作骨質(zhì)疏松兔模型，在脛骨干骺端近端種植鈦棒，間歇運(yùn)用PTH（1-34）12 周，發(fā)現(xiàn)可以增強(qiáng)鈦棒周圍的骨反應(yīng)，并且顯著增加骨密度。提示特立帕肽可以促進(jìn)骨整合和骨-種植體界面的強(qiáng)度?？梢?，在將來臨床中，PTH（1-34）有望成為用于促進(jìn)植入物骨整合的一種很有前景的藥物。不過，上述臨床病例報(bào)道數(shù)較少，且僅通過X 線片來評估植入物骨整合程度。少量的動物實(shí)驗(yàn)中一般也只檢測骨組織計(jì)量和生物力學(xué)指標(biāo)，故PTH（1-34）促進(jìn)植入物骨整合的作用尚需更多高質(zhì)量的研究予以證實(shí)，其具體的作用機(jī)制也亟待探討和闡明。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種存在于哺乳動物胞漿的一種非典型絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細(xì)胞發(fā)揮功能的重要調(diào)節(jié)蛋白，于其伴侶蛋白成份以及底物對雷帕霉素的敏感性和特異性，mTOR 可分為兩種不同的蛋白復(fù)合物——mTORC1和mTORC2，近年來，mTORC2 在調(diào)控細(xì)胞遷移、黏附和細(xì)胞骨架重組的關(guān)鍵作用也得到證實(shí)［7-9］。在小鼠的受精卵中，mTORC2/Akt 在受精卵早期發(fā)育中參與肌動蛋白的重組［10］。SEN等［11］研究發(fā)現(xiàn)予以物理刺激干預(yù)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）后，其纖維狀肌動蛋白（F-actin）及黏附斑蛋白（vinculin）的表達(dá)升高，且與mTORC2 通路有關(guān)，當(dāng)前有關(guān)mTORC2 調(diào)控細(xì)胞遷移及黏附的研究主要集中在腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞，而mTORC2 是否參與調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和成骨細(xì)胞的遷移及黏附尚不清楚。

目前，PTH（1-34）能否促進(jìn)BMSCs的遷移、黏附作用的研究以及mTORC2 信號通路在其中的調(diào)控機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，因此，本研究探究特立帕肽對細(xì)胞骨架與黏附斑的影響，以及mTORC2 信號在其中介導(dǎo)的作用，探索植入物骨整合的分子機(jī)制，對防治植入物松動及失敗，具有現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器垂直板蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀（Bio-Rad，USA），光學(xué)倒置顯微鏡（Olympus，IX70，Japan），BeckMan-22R 高速低溫離心機(jī)（Beck-Man，USA）

1.1.2 主要試劑F12 培養(yǎng)基（Gibco，China），胰酶（Gibco，USA），青、鏈霉素雙抗（Gibco，USA），βactin 抗體（Cell Signaling Technology，CST，USA）Vinculin抗體（Cell Signaling Technology，CST，USA），特立帕肽（HEHOP-1601 中國蘇州賽業(yè)生物科技有限公司）。

1.2 大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)筆者從4～6 周齡的Sprague-Dawley（SD）大鼠中提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)大鼠購于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于無特定病原體（specific pathogen free，SPF）實(shí)驗(yàn)室，本研究經(jīng)中山大學(xué)動物保護(hù)委員會批準(zhǔn)（中山大學(xué)動物保護(hù)委員會批準(zhǔn)）：［2014］52），并按照《實(shí)驗(yàn)室動物使用指南》執(zhí)行。BMSCs 提取方法與鑒定同前［12］。取大鼠股骨和脛骨，無菌剝離軟組織。取BMSCs，用5 mL 注射器沖洗骨髓腔。細(xì)胞在1 000g離心5 min，懸浮于添加10%胎牛血清的DMEM 中。細(xì)胞保持在37 ℃5%的二氧化碳的環(huán)境下。細(xì)胞孵育3 d 后，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）沖洗一次貼壁層。每2 天更換一次培養(yǎng)基。細(xì)胞在80%～90%的融合后進(jìn)行再培養(yǎng)。采用第三代BMSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 劃痕實(shí)驗(yàn)BMSCs 以5×105個(gè)細(xì)胞的濃度種在6 孔板中。當(dāng)細(xì)胞生長到90%匯合時(shí)，更換培養(yǎng)基，血清饑餓24 h。用無菌200 μL 槍頭劃開細(xì)胞層。用PBS 洗滌細(xì)胞兩次，去除分離的細(xì)胞。隨后分別用特立帕肽、雷帕霉素、PP242處理細(xì)胞。在0、24 h用顯微鏡觀察細(xì)胞（Leica，DMI3000 B，德國）。

1.4 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)采用24孔雙室transwell 系統(tǒng)（孔徑8 mm，直徑6.5 mm）（Corning，NY，USA）。上層加入無血清培養(yǎng)基并放入37 ℃孵育1 h，下層加入特立帕肽以及兩種抑制劑，BMSCs 血清饑餓12 h，以1×105個(gè)細(xì)胞的密度/毫升（100 μL）加入到上層。然后將小室放置在培養(yǎng)箱中24 h，從下腔收集遷移的細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色（Beyotime，Haimen，China）。選擇5個(gè)隨機(jī)顯微鏡視野（Leica，DMI3000 B，Germany）統(tǒng)計(jì)遷移的細(xì)胞。

1.5 黏附實(shí)驗(yàn)用10 μg/mL的FN（BIOYK，USA）預(yù)鋪96 孔板，70 μL/孔，4 ℃后，PBS 洗3 遍，再用1%BSA 于37 ℃封閉1 h，PBS 洗3 遍。待測細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為5 × 105/mL分別接種于預(yù)鋪FN的96 孔板中，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37 ℃孵育2 h 后，PBS 洗去未黏附的細(xì)胞。按照每孔加入100 μL 甲醇，固定15 min 每孔加入100 μL 吉姆薩染液，染色15 min，PBS 洗去染液倒置顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)黏附細(xì)胞數(shù)量病拍照，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.6 免疫熒光不同處理組的細(xì)胞加入甲醛處理15 min，使用PBS 沖洗3 遍，洗去甲醛固定液后用1%的TritonX-100處理5 min。使用PBS 洗去Triton-X100 后，5%BSA 室溫封閉30 min。PBS 配制一抗β-actin 抗體（Cell Signaling Technology，CST，USA）Vinculin抗體（Cell Signaling Technology，CST，USA），4 ℃過夜，PBS 洗3次，每次洗5 min。二抗孵育30～40 min。PBS 洗3次，每次洗5 min。滴加DAPI避光孵育5 min 對標(biāo)本進(jìn)行染核，用PBS 洗去多余的DAPI，用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 版軟件進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較用多組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 特立帕肽能促進(jìn)BMSCs的遷移和黏附能力通過劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測特立帕肽是否能促進(jìn)BMSCs的遷移。對照組的愈合率為（0.21±0.067），特立帕肽濃度為10、20、50 nmol/L時(shí)各組細(xì)胞的愈合率分別為（0.75±0.025）、（0.80±0.037）、（0.78±0.035），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），遷移的細(xì)胞數(shù)分別為（45.33±7.02）、（38.67±4.04）、（41.67±5.13），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同濃度的特立帕肽處理組的細(xì)胞愈合率和遷移的細(xì)胞數(shù)目與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

通過黏附實(shí)驗(yàn)比較特立帕肽是否能促進(jìn)BMSCs的黏附能力。對照組黏附的細(xì)胞數(shù)為（32.8±7.09），在10、20、50 nmol/L 濃度時(shí)3 組黏附的細(xì)胞數(shù)分別為（82.6±5.86）、（82.8±8.32）、（106.6±13.94），與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。證明特立帕肽能促進(jìn)BMSCs的遷移黏附能力。見圖1、表1。

2.2 mTORC2 信號通路參與BMSCs 特立帕肽依賴的遷移和黏附通過加入mTORC1 通路的抑制劑雷帕霉素和mTORC1/2 通路的抑制劑PP242，來驗(yàn)證mTORC2 信號通路是否參與特立帕肽依賴的遷移和黏附。與對照組相比，特立帕肽組愈合率為（0.82±0.035 24），遷移的細(xì)胞為（54.67±6.03）促進(jìn)了細(xì)胞的遷移，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而PP242 組愈合率為（0.038 6±0.013 2），遷移的細(xì)胞為（3±2）可以抑制特立帕肽的促進(jìn)作用，并且加入特立帕肽后亦不能恢復(fù)細(xì)胞的遷移能力愈合率（0.044±0.022）遷移的細(xì)胞為（4.67±2.08），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且PP242 組和PP242加特立帕肽組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而加入mTORC1 通路抑制劑的雷帕霉素組愈合率（0.33±0.025），遷移的細(xì)胞為（25.33±4.51），與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。黏附實(shí)驗(yàn)中，PP242組黏附的細(xì)胞（9.30±2.44），加入特立帕肽后黏附的細(xì)胞為（12.35±3.64），之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；單獨(dú)加入特立帕肽組黏附的細(xì)胞為（89.6±7.86），與對照組（36.8±7.08）對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而加入雷帕霉素組黏附的細(xì)胞為（32.5±4.95），與對照組對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明，特立帕肽更可能通過mTORC2 通路發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞遷移及黏附的功能。見圖2、表2。

2.3 特立帕肽通過mTORC2 信號通路調(diào)控BMSCs 骨架和黏附斑在特立帕肽的作用下，BMSCs的中間絲和微絲結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞呈現(xiàn)得更大且呈多邊形，黏著斑蛋白的表達(dá)增加（圖3B 紅點(diǎn)為黏著斑蛋白，由綠色箭頭所示），反映出細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和黏附能力。而在PP242的作用下，胞體變小，且呈現(xiàn)圓形或橢圓形中間絲和微絲結(jié)構(gòu)紊亂，骨架纖維較小，結(jié)構(gòu)不甚清晰，黏著斑蛋白的表達(dá)減少，加入特立帕肽后亦不能恢復(fù)其形態(tài)。與對照組相比，雷帕霉素對細(xì)胞骨架的影響不大，且加入特立帕肽后對細(xì)胞的骨架纖維和結(jié)構(gòu)有一定的恢復(fù)，對黏著斑的影響不大。進(jìn)一步說明特立帕肽能通過mTORC2 通路影響細(xì)胞骨架的變化從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移和黏附。見圖3。

3 討論

特立帕肽能促進(jìn)細(xì)胞的遷移和黏附。骨向種植體表面的有效向內(nèi)生長是骨整合的重要組成部分，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞向表面的遷移黏附和分化是促進(jìn)骨愈合的關(guān)鍵［5，13-15］。這兩種過程都是成骨分化和骨礦化所必需的，因此，成功的骨整合取決于遷移和黏附的生物過程。有研究PTH 可以顯著增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）向腰椎區(qū)域的遷移，其中MSCs 分化為骨形成細(xì)胞［16］。而黏附能力也是影響細(xì)胞-材料相互作用的強(qiáng)弱的一個(gè)因素，黏附因子如vinculin的表達(dá)與細(xì)胞黏附能力有關(guān)，MSC 對底物特性敏感，其黏附能力決定了與植入物接觸后細(xì)胞的增殖和分化能力［17］。本研究通過劃痕實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)、黏附實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PTH（1-34）不僅可以促進(jìn)BMSCs的遷移，還可以促進(jìn)BMSCs的黏附能力。

圖1 不同濃度的特立帕肽對BMSCs 愈合率（A）、遷移（B）和黏附能力（C）的影響Fig.1 Effect of different concentrations of teriparatide on healing rate（A），migration（B）and adhesion capacity（C）of BMSCs

表1 不同濃度的特立帕肽對BMSCs 愈合率、遷移和黏附的量化數(shù)據(jù)Tab.1 Quantitative data of different concentrations of teriparatide on the healing rate，migration and adhesion of BMSCs ±s

表1 不同濃度的特立帕肽對BMSCs 愈合率、遷移和黏附的量化數(shù)據(jù)Tab.1 Quantitative data of different concentrations of teriparatide on the healing rate，migration and adhesion of BMSCs ±s

注：與對照組比較，*P＜0.05

Wound closure area Transwell cell counting Adhesion cell counting Control 0.21±0.07 18.00±4.58 32.8±7.09 1 nmol/L 0.33±0.046 28.00±4.58 46.00±6.08 10 nmol/L 0.75±0.025*45.33±7.02*82.6±5.86*20 nmol/L 0.80±0.037*38.67±4.04*82.8±8.32*50 nmol/L 0.78±0.035*41.67±5.13*106.6±13.9*

特立帕肽能通過mTORC2 通路調(diào)控細(xì)胞骨架和黏附斑從而影響細(xì)胞的遷移黏附。良好的骨整合依賴于BMSCs向植入物遷移及黏附。細(xì)胞骨架和黏著斑是細(xì)胞發(fā)揮遷移黏附作用的功能基礎(chǔ)［13，18］。細(xì)胞遷移過程中形狀和運(yùn)動的改變都取決于細(xì)胞骨架和黏著斑的直接變化。細(xì)胞骨架還具有幫助細(xì)胞移動行走的功能，細(xì)胞骨架控制核的形態(tài)和剛度是骨橋蛋白誘導(dǎo)BMSCs 遷移所必需的［19］。細(xì)胞骨架的形成是以vinculin 為標(biāo)志蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)vinculin和actin 聯(lián)合參與黏附斑介導(dǎo)的機(jī)械應(yīng)力傳導(dǎo)［20］。提示骨整合區(qū)域的細(xì)胞骨架調(diào)整和黏附斑的形成在植入物骨整合中發(fā)揮著作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用mTORC1的抑制劑雷帕霉素，特立帕肽的促進(jìn)作用受影響不大，而應(yīng)用mTORC1/2 抑制劑PP242，則PTH（1-34）的促進(jìn)遷移黏附的作用明顯被抑制。而筆者通過黏附斑和細(xì)胞骨架染色觀察到在特立帕肽的作用下BMSCs

變得更大且呈多邊形，呈現(xiàn)更多的骨架纖維和黏連，而pp242 可以顯著抑制特立帕肽的作用，讓細(xì)胞的肌動蛋白末端的骨架纖維較小，骨架結(jié)構(gòu)紊亂。提示PTH（1-34）可以通過mTORC2 通路調(diào)控細(xì)胞骨架和黏附斑從而影響細(xì)胞的遷移黏附。

圖2 特立帕肽和mTOR 通路抑制劑對BMSCs 愈合率（A）、遷移（B）和黏附（C）的影響Fig.2 Effect of teriparatide and mTOR pathway inhibitors on BMSCs wound closure rate

表2 特立帕肽和mTOR 通路抑制劑對BMSCs 愈合率、遷移和黏附量化數(shù)據(jù)Tab.2 Quantitative data on the wound closure rate，migration and adhesion of BMSCs by teriparatide and mTOR pathway inhibitors

綜上所述，特立帕肽可影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞骨架和黏附斑的變化，并且可能由mTORC2 信號通路所介導(dǎo)，這也可能是特立帕肽促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和黏附，進(jìn)而促進(jìn)植入物骨整合的分子機(jī)制。

本研究首次提出mTORC2 信號通路可能參與調(diào)控PTH（1-34）促進(jìn)BMSCs 在植入物表面的遷移和黏附，為骨組織工程領(lǐng)域中細(xì)胞與材料相互作用方面提供了新的觀點(diǎn)，也將為臨床防止植入物松動提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。盡管本實(shí)驗(yàn)初步闡明mTORC2 信號通路可能參與調(diào)控特立帕肽促進(jìn)BMSCs的遷移黏附，但是還具有一定的局限性。研究使用的是大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，而不是基因上更適用的小鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞或更具臨床轉(zhuǎn)化性的人體細(xì)胞模型。并且缺乏相關(guān)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來探究PTH（1-34）對BMSCs的遷移和黏附的影響，還需要進(jìn)一步深入研究。未來，筆者還將進(jìn)一步探討PTH（1-34）是否通過mTORC2 通路促進(jìn)BMSCs的成骨分化功能的影響。擬采用成骨分化因子檢測、骨植入物骨組織計(jì)量及生物力學(xué)檢測電鏡掃描，microCT等方法，并通過動物，從分子、細(xì)胞和動物水平來進(jìn)一步研究mTORC2 信號通路在PTH（1-34）促進(jìn)植入物骨整合中的作用及分子機(jī)制。