解磷菌的分離、篩選、鑒定及解磷能力研究

上官亦卿 常帆 呂睿 齊凡 賈鳳安 王艷 丁浩

摘要：為開發(fā)高效微生物解磷肥，利用解磷菌選擇培養(yǎng)基（蒙吉娜卵磷脂培養(yǎng)基）從陜西省西安市周至縣獼猴桃園農(nóng)田土壤中分離出11株解磷菌，通過純化培養(yǎng)，篩選出1株高效解磷菌JYP9。利用16S rDNA基因序列分析方法對(duì)該菌株的分類信息進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果表明該菌株為假單胞菌（Pseudomonas extremorientalis）。并用解磷圈法和液體搖瓶培養(yǎng)法，分別以卵磷脂為惟一磷源，確定了該菌株的最適培養(yǎng)溫度為26 ℃、最適轉(zhuǎn)速為200 r/min、最適起始pH為7和最適起始接種量為2%。

關(guān)鍵詞：解磷菌;篩選;鑒定;最適條件

中圖分類號(hào)：S154.39? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）01-0030-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.01.007? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Isolation，Screening，Identification and Phosphate Solubilizing Ability of Phosphate Solubilizing Bacteria

SHANGGUAN Yi-qing1，2，CHANG Fan2，LYU Rui2，QI Fan1，JIA Feng-an2，WANG Yan2，DING Hao2

（1.Shaanxi Academy of Sciences，Xian 710043，China;

2.Microbial Metabolism Research Center，Shaanxi Province Institute of Microbiology，Xian 710043，China）

Abstract： In order to develop an efficient microbial fertilizer solution， 11 strains from the farm-land soil of actinidia park in Zhouzhi county， Shaanxi prvince， were isolated， using phosphate volubility bacteria selective culture medium （Mongolia lecithin culture medium）. A strain of phosphate volubility bacteria JYP9 was screened through purification cultivar. And classification information of this strain was identified by using 16S rDNA gene sequence analysis， the results showed that the strain was a Pseudomonas extremorientalis. Then the phosphate solubilizing method and the liquid shake flask method were used in the experiment to confirm the optimum cultivation condition of JYP9 with lecithin as the only phosphorus source. The results showed that the optimal temperature was 26 ℃， optimal rotational was 200 r/min， optimal pH was 7， and optimum initial inoculation amount was 2%.

Key words： phosphate solubilizing bacteria; screen; identify; optimum condition

磷是植物生長所需的一種主要營養(yǎng)元素，但植物對(duì)土壤中的磷元素利用率很低，嚴(yán)重影響著植物的生長[1]。有機(jī)磷是土壤磷的重要組成部分，一般占土壤全磷的20%～50%，其中植酸磷占有機(jī)磷的10%～50%[2]，是土壤有機(jī)磷的主要存在形式。解磷菌能將植物難以吸收利用的難溶性或不溶性磷轉(zhuǎn)化為可利用的形態(tài)，提高土壤中磷素的利用效率，減少化學(xué)肥料的施用，降低農(nóng)業(yè)投入成本。因此，對(duì)土壤環(huán)境進(jìn)行微生物修復(fù)是提高作物產(chǎn)量、解決土壤速效磷缺乏的重要途徑之一[3，4]。

存在于土壤中的根際細(xì)菌、內(nèi)部共生細(xì)菌被認(rèn)為是最有效的解磷微生物，它們能夠利用自身的代謝物質(zhì)[5]、通過NH4+同化作用[6]或釋放H2S[7]將被土壤固定的無效態(tài)磷釋放出來。這些細(xì)菌能夠?qū)⒈煌寥拦潭ǖ牡V物態(tài)磷釋放出來，但是其在植物根際的數(shù)量不足以與其他微生物競(jìng)爭(zhēng)，難以揮發(fā)其活性，因此篩選出具有高效溶磷能力的菌株，并將其添加到生物有機(jī)肥中，以供給作物充足的磷素顯得尤為重要。中國對(duì)解磷細(xì)菌的研究起步于20世紀(jì)50年代，研究人員從東北黑土和灰化土中分離出具有解磷功能的巨大芽孢桿菌[8]?，F(xiàn)在對(duì)溶磷菌的研究主要集中于溶解無機(jī)磷菌株的篩選方面[9-11]，對(duì)于土壤難溶性有機(jī)磷解磷菌的研究卻鮮有報(bào)道[12]。本研究選擇一種有機(jī)磷培養(yǎng)基（蒙吉娜卵磷脂培養(yǎng)基），以卵磷脂作為惟一磷源，通過選擇性培養(yǎng)從獼猴桃大田土壤中分離出11株解磷細(xì)菌，并通過分離、純化、復(fù)篩，得到一株解磷能力較強(qiáng)的細(xì)菌 JYP9，研究該菌株的生理生化特征及對(duì)卵磷脂的降解特性，確定菌株的最適初始接種量、最適pH、最適生長溫度及最佳轉(zhuǎn)速對(duì)解磷能力的影響，旨在確定該菌株的生長情況及解磷能力，為開發(fā)新的成本低、效果好且不污染環(huán)境的解磷菌，充分利用土壤中的磷素資源提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)具有十分重要的意義。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 土樣? 土壤樣品采集自陜西省西安市周至縣獼猴桃園，釆集方法為五點(diǎn)采樣法，去除表層土壤，用土鉆取深度為0～20 cm的土壤，將5個(gè)不同點(diǎn)的土樣混合為1份，裝入無菌樣品采集袋，標(biāo)簽注明采樣信息，放入4 ℃冰箱保存。

1.1.2? 樣品? 市購卵磷脂。

1.1.3? 培養(yǎng)基? ①分離培養(yǎng)基[13，14]。蔗糖5.0 g，KH₂PO₄

0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，CaCO₃5 g，瓊脂20 g，去離子水1.0 L，pH 7.2～7.5，121 ℃滅菌20 min。②蒙吉娜卵磷脂培養(yǎng)基[15]（有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基）。蔗糖（葡萄糖）10.0 g，（NH₄）₂SO₄0.5 g，NaCl 0.3 g，MgSO₄·7H₂O 0.3 g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O（微量）0.03 g，NaCl 0.3 g，MnSO₄·7H₂O（微量）0.03 g，CaCO₃5.0 g，卵磷脂1.0 g（卵磷脂用時(shí)先溶于75%乙醇中），去離子水1 L，瓊脂18～20 g， pH 7.2～7.4。③牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，去離子水1 L，固體培養(yǎng)基加瓊脂 15～20 g。

所有培養(yǎng)基均置于0.05 MPa滅菌鍋中滅菌20 min后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.4? 種子液? 從保存培養(yǎng)基上挑取菌種接種至150 mL有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中的三角瓶中，放置于28 ℃、200 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h。

1.1.5? 其他溶液

1）17.5 mol/L硫酸鉬銻儲(chǔ)存液。取去離子水400 mL，放入1 L燒杯中，將燒杯浸入冷水中，之后注入分析純濃硫酸208 mL，并不斷攪拌，冷卻至室溫。分析純鉬酸銨20 g溶于200 mL去離子水，將硫酸溶液緩慢倒入鉬酸銨溶液中，并不斷攪拌，再加入100 mL 5 g/L（0.5 g）酒石酸銻鉀溶液，去離子水定容至1 L，搖勻，保存。100 mL儲(chǔ)液加入1.5 g抗壞血酸（VC）組成鉬銻抗顯色劑（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

2）磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱取經(jīng)105 ℃下烘干2 h的磷酸二氫鉀（GB1274，優(yōu)級(jí)純）0.439 0 g，用水溶解后，加入5 mL濃硫酸，加水定容至1 L，該溶液含磷100 mg/L，放于冰箱可供長期使用。

1.2? 方法

1.2.1? 解磷菌的富集? 取3只250 mL錐形瓶，各裝入含無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基100 mL，向錐形瓶中分別加入1 g土壤樣品，搖床培養(yǎng)3 d（溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min），吸取錐形瓶底部菌液進(jìn)行轉(zhuǎn)接，富集解磷菌，每次轉(zhuǎn)接前將菌液涂布到平板上計(jì)數(shù)。

1.2.2? 解磷菌的初篩? 將富集培養(yǎng)基中的菌種轉(zhuǎn)接到含卵磷脂培養(yǎng)基的平板上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，出現(xiàn)菌落后，挑取單菌落轉(zhuǎn)接至新的固體培養(yǎng)基上，重復(fù)上述操作3次，將單菌落放入冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3? 解磷菌的復(fù)篩? 將初篩出的菌株轉(zhuǎn)接到裝有100 mL卵磷脂液體培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)3 d，涂布，記錄菌數(shù)，同時(shí)測(cè)量溶磷圈的大小，選取溶磷圈大的菌株為目標(biāo)菌。

1.2.4? 菌株形態(tài)學(xué)及生理生化特征? 將分離純化得到的菌株在固體平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，在溫度為30 ℃的條件下培養(yǎng)2 d，觀察菌株生長狀況及菌落特征。

1.2.5? 菌株16S rDNA序列分析及比對(duì)? 選用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3′）建立PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）為5×One Taq Standard Reaction Buffer 10 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，10 μmol/L Forward Primer 1 μL，10 μmol/L Reverse Primer 1 μL，One Taq DNA Polymerase 1 μL，Template DNA 2.0 μL，Nuclease-Free Water 34 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán);72 ℃后延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)定基因序列， 利用 BLAST將菌株的基因序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較，選取相似性較高的模式菌株序列，用MEGA5.1中Neighbor-Joining法比較同源性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6? 菌株解磷能力測(cè)定? 配制解磷培養(yǎng)基（無磷），按50 mL每瓶分裝于250 mL錐形瓶中，各加入0.1 g準(zhǔn)確稱取的卵磷脂，在121 ℃條件下滅菌20 min，每個(gè)錐形瓶接入2%待測(cè)菌懸液，30 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)液倒入離心管配平，10 000 r/min離心5 min，取上清液10 mL，加入顯色劑5 mL，定容至50 mL，最后放置30 min，進(jìn)行反應(yīng)后（抗銻比色法[12]）測(cè)定上清液中速效磷含量。

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。將配好的磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL到20 mL的玻璃管中，然后吸取5 mL顯色劑到玻璃管中，最后都定容到20 mL，反應(yīng)30 min后，進(jìn)行速效磷含量的測(cè)定。

2）最適生長溫度測(cè)定。按2%接種量將菌株接入培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)pH為7將菌種接于解磷液體培養(yǎng)基中，分別置于溫度為24、26、28、30、32 ℃的搖床中培養(yǎng)5 d后將菌液倒入離心管配平，然后以? 10 000 r/min離心5 min，取上清，定容至50 mL，以不接菌處理為對(duì)照，檢測(cè)速效磷含量。

3）最適生長轉(zhuǎn)速測(cè)定。按試驗(yàn)得出的最適接種量將菌液接種到解磷液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH為7，溫度設(shè)置為30 ℃，調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速分別為140、160、180、200、220 r/min，培養(yǎng)5 d后將菌液倒入離心管中配平，然后以10 000 r/min離心5 min，取上清，定容至50 mL，以不接菌處理為對(duì)照，檢測(cè)速效磷含量。

4）最適初始pH測(cè)定。配制解磷液體培養(yǎng)基，分組調(diào)節(jié)pH為5、6、7、8、9，按最適初始接種量和最適生長轉(zhuǎn)速將菌液接種到解磷菌篩選培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)5 d（溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min）后將菌液倒入離心管中配平，然后以10 000 r/min離心5 min，取上清，定容至50 mL，以不接菌處理為對(duì)照，檢測(cè)速效磷含量。

5）最適初始接種量測(cè)定。配制液體培養(yǎng)基，將菌液進(jìn)行稀釋，按1%、2%、3%、4%和5% 5個(gè)接種量接入到解磷培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)5 d（溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min）后將菌液倒入離心管中配平，然后以10 000 r/min離心5 min，取上清，定容至50 mL，以不接菌處理為對(duì)照，檢測(cè)速效磷含量。

1.2.7? 數(shù)據(jù)處理? 數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 19統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 解磷菌的篩選

對(duì)土壤樣品進(jìn)行涂布處理，初步得到菌株56株，經(jīng)復(fù)篩，得到具有高效解磷能力的菌株11株，通過鉬藍(lán)比色法測(cè)定解磷量，計(jì)算時(shí)稀釋倍數(shù)為50倍，所有的數(shù)據(jù)均為3次測(cè)定的平均值。由表1可知，11株解磷菌的解磷能力均較強(qiáng)，比對(duì)照組都有明顯增加。其中，JYP6解磷效果最弱，菌液中速效磷含量最低，比空白對(duì)照增加了0.12%;而菌株JYP9培養(yǎng)液中速效磷含量最高，比空白對(duì)照增加了93.84%，其解磷能力最強(qiáng)，菌株JYP9的解磷率比其他菌株有顯著增加，因此，本試驗(yàn)以JYP9菌株為研究對(duì)象，對(duì)其菌落特征和解磷特性做進(jìn)一步研究。

2.2? 菌落形態(tài)

采用平板劃線法將JYP9菌株進(jìn)行純化，并轉(zhuǎn)接至固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2 d后觀察菌株形態(tài)。如圖1所示，菌株單菌落呈水滴裝，菌落無色透明，邊緣光滑，表面濕潤且黏稠，菌落直徑約為0.5 mm。單菌落的溶解以及解磷圈形態(tài)見圖2，解磷圈的內(nèi)外直徑比為0.913。

2.3? 16S rDNA測(cè)序分析

菌株JYP9經(jīng)16S rDNA測(cè)序獲得1 418 bp的基因片段，將序列信息提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，利用BLAST將菌株的基因序列進(jìn)行相似性比較，結(jié)果表明，菌株JYP9與假單胞菌屬同源性很高，從16S rDNA序列相似性比較結(jié)果看，菌株JYP9與Pseudomonas extremorientalis相似性達(dá)到100%;選取17株同源性較高的假單胞菌菌株序列與待測(cè)菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示，從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，菌株JYP9與P. extremorientalis相似性達(dá)到100%且處于同一分支，距離最近，鑒定菌株JYP9為P. extremorientalis。

2.4? 菌株解磷能力測(cè)定結(jié)果

2.4.1? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定? 用鉬銻抗分光光度法測(cè)定磷。在一定酸度和銻離子存在的情況下，磷酸根與鉬酸銨形成銻酸鉬混合雜多酸，它在常溫下可迅速被抗壞血酸還原為鉬藍(lán)，在660 nm波長下測(cè)定。試驗(yàn)的適宜酸度為0.28～0.38 mol/L H2SO4，適宜時(shí)間為20～60 min，可穩(wěn)定24 h，磷含量為0.5～2.0 mg/L時(shí)符合線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見圖4。

2.4.2? 最適培養(yǎng)溫度? 由圖5可知，溫度的變化對(duì)菌株的生長有顯著影響，隨著溫度的升高，菌株解磷能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)溫度達(dá)到26 ℃時(shí)，解磷量達(dá)到最高，菌液中的速效磷含量達(dá)到8.12 mg/L，比24 ℃時(shí)增加了4.94 mg/L，而溫度為32 ℃時(shí)，解磷量為2.23 mg/L，可能是溫度升高導(dǎo)致菌株生長受到抑制，使解磷能力降低，因此確定菌株JYP9的最適生長溫度為26 ℃。

2.4.3? 最適培養(yǎng)轉(zhuǎn)速? 由圖6可知，不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)解磷能力有明顯影響，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速增加時(shí)，菌株解磷能力逐漸增加，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到200 r/min時(shí)，菌液中速效磷含量最高，菌液中的速效磷含量達(dá)到7.48 mg/L，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到220 r/min時(shí)，解磷能力降低，菌液中速效磷含量為7.10 mg/L，比200 r/min時(shí)減少了0.38 mg/L，二者有一定差異，其原因可能是轉(zhuǎn)速過高，產(chǎn)生的剪切力對(duì)菌體造成機(jī)械損傷，降低了菌株的解磷能力。由此可知，菌株JYP9的最適培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為200 r/min。

2.4.4? 最適培養(yǎng)pH? 由圖7可以看出，不同pH對(duì)菌株生長及解磷能力有顯著影響，pH 7時(shí)解磷量達(dá)到最大，菌液中的速效磷含量達(dá)到7.53 mg/L，與其他pH有明顯差異。因此確定，菌株JYP9的最適生長pH為7，且菌株適合生長于中性環(huán)境中，這對(duì)于菌株的大規(guī)模生產(chǎn)有重要指導(dǎo)意義。

2.4.5? 最適初始接種量? 不同的初始接種量對(duì)解磷能力有一定的影響，由圖8可以看出，隨接種濃度的增加，速效磷含量呈先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)接種量為2%時(shí)，菌液中速效磷含量達(dá)到最大，為7.36 mg/L，比接種量為1.0%時(shí)高了4.75 mg/L，有顯著性差異，而當(dāng)接種量為3%時(shí)，解磷量為6.41 mg/L，與2%時(shí)也有顯著性差異，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選取2%為最適接種量。

3? 小結(jié)與討論

隨著種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，農(nóng)作物產(chǎn)量和復(fù)種指數(shù)的不斷提高，土壤中耗磷量的不斷增加，全國耕地土壤速效磷含量逐年下降，南方各地土壤缺磷情況更為嚴(yán)重。土壤中的含磷硅酸鹽礦物只有在理化因素和微生物的作用下，通過分化和分解逐步釋放出磷供作物生長利用。本研究從陜西省周至縣獼猴桃園土壤中篩選到11株高效解磷菌，通過鑒定和解磷能力的測(cè)定，復(fù)篩出1株解磷能力最強(qiáng)的菌株，命名為JYP9，通過16S rDNA測(cè)序，并對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，確定其為假單胞菌（Pseudomonas extremorientalis）。

解磷微生物的解磷機(jī)理非常復(fù)雜，有學(xué)者認(rèn)為解磷微生物通過溶解或礦化作用能使土壤中難溶態(tài)磷或非溶性有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為可供植物利用的速效磷形式[16]。一般認(rèn)為無機(jī)解磷微生物能向外分泌酸性物質(zhì)，如葡萄糖酸、酒石酸、檸檬酸等來降低土壤環(huán)境的pH，使難溶性的磷酸鹽溶解;而有機(jī)解磷微生物向外分泌酶類物質(zhì)，如磷酸酶、核酸酶等將磷酸脂等有機(jī)磷鹽礦化。本試驗(yàn)主要對(duì)有機(jī)解磷微生物JYP9進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，溫度為24 ℃和26 ℃的解磷量差異很大，26 ℃時(shí)解磷量達(dá)到最大，之后隨著溫度的升高，解磷量下降;在轉(zhuǎn)速為140～200 r/min時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速增加，解磷量也增加，表明接觸面積越大，解磷量就越大，但是過快的轉(zhuǎn)速（220 r/min）會(huì)使解磷量下降，可能是因?yàn)樗俣冗^快而導(dǎo)致培養(yǎng)液中的營養(yǎng)沒有充分吸收;pH對(duì)解磷量有顯著影響，pH 7時(shí)解磷量最大，但是過酸或者過堿都會(huì)影響解磷量，而且影響顯著，顯然JYP9適宜在中性條件下生存;接種量對(duì)解磷量影響顯著，2%的接種量與1%的接種量相比，解磷量增加了很多，但是接種量過大反而會(huì)抑制生長，導(dǎo)致解磷量減少。由此可知，該菌株的最適培養(yǎng)條件為初始接種量2%、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、培養(yǎng)溫度26 ℃、初始pH 7。該結(jié)果為菌株的開發(fā)利用提供了數(shù)據(jù)支持和理論基礎(chǔ)。

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