土霉素廢水對斑馬魚的生物毒性效應(yīng)研究

高問 武鵬鵬 王雅學(xué) 沈洪艷

摘要：為了明確土霉素廢水的生物毒性效應(yīng)，采用暴露實(shí)驗(yàn)方法，研究了土霉素廢水對斑馬魚的毒性效應(yīng)。結(jié)果顯示：對斑馬魚而言，土霉素廢水屬于低毒物質(zhì)，斑馬魚暴露3～9 d時(shí)，其SOD活性和POD活性受到不同程度的抑制，12 d時(shí)受到顯著誘導(dǎo)（0.01

關(guān)鍵詞：環(huán)境毒理學(xué);土霉素廢水;斑馬魚;超氧化物歧化酶;丙二醛;DNA損傷

中圖分類號：X503225;R994.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

GAO Wen，WU Pengpeng，WANG Yaxue，et al.Study of the biological toxicity of oxytetracycline wastewater on zebrafish[J].Journal of Hebei University of Science and Technology，2019，40（1）：38-44.Study of the biological toxicity of oxytetracycline wastewater on zebrafish

GAO Wen1，2， WU Pengpeng1，2， WANG Yaxue1，2， SHEN Hongyan1，2

（1.School of Environmental Science and Engineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang， Hebei 050018，China;2. Laboratory of Hebei Province for Medical Molecular Chemistry， Shijiazhuang， Hebei 050018，China）

Abstract：In order to clarify the biotoxic effects of oxytetracycline wastewater， the toxicity effects of oxytetracycline wastewater on zebrafish are studied by exposure test. The results show that oxytetracycline wastewater is a low toxic substance to zebrafish. The SOD activity and POD activity of zebrafish are differently inhibited at 3～9 d. At 12 d， SOD activity and POD activity are significantly induced （0.01

Keywords：environmental toxicology; oxytetracycline wastewater; zebrafish; superoxide dismutase; malonaldehyde; DNA damage

作為一種高效藥物，抗生素近年來被廣泛用于治療人和動物疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球抗生素的年使用量為10萬～20萬t，其中60%的抗生素由中國生產(chǎn)。中國是生產(chǎn)和使用抗生素的大國，土霉素產(chǎn)量居世界第一[2-4]。生產(chǎn)土霉素需經(jīng)過菌種發(fā)酵和提取精制，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量廢水，生產(chǎn)1 t土霉素廢水排放量平均為1.3 t[5]。根據(jù)中國環(huán)境保護(hù)方面的相關(guān)規(guī)定，抗生素類制藥企業(yè)需要在廠內(nèi)配備污水處理系統(tǒng)，生產(chǎn)廢水經(jīng)處理達(dá)標(biāo)后才能排入市政管網(wǎng)。大部分制藥廠對土霉素生產(chǎn)廢水采用生化法處理，經(jīng)此方法處理后雖然BOD，COD及氨氮等污染物可以達(dá)標(biāo)排放，但其中仍有土霉素殘留。據(jù)報(bào)道：美國2個(gè)污水處理廠的抗生素去除率分別為23%和72%，中國3個(gè)污水處理廠對抗生素的去除率為56%～70%[6-7]，WATKINSON等[8]在澳大利亞監(jiān)測的污水處理廠的抗生素質(zhì)量濃度高達(dá)65 μg/L。沈洪艷等[9]采用暴露實(shí)驗(yàn)方法研究了不同體積比鏈霉素生產(chǎn)廢水對錦鯉魚抗氧化酶和MDA含量的影響，結(jié)果表明，處理后的鏈霉素廢水低濃度長期暴露會對錦鯉魚的抗氧化系統(tǒng)造成傷害。河北科技大學(xué)學(xué)報(bào)2019年第1期高問，等：土霉素廢水對斑馬魚的生物毒性效應(yīng)研究吳志剛等[10]研究了處理后的青土霉素廢水對錦鯉魚的抗氧化酶活性和MDA含量的影響，同樣得到了青土霉素廢水會對錦鯉魚抗氧化系統(tǒng)造成傷害的結(jié)論。蔡夢婷等[11]以土霉素純品和重金屬復(fù)合為實(shí)驗(yàn)材料，探討了抗生素-重金屬復(fù)合暴露的水生態(tài)毒性。聞洋等[12]研究了88%鹽酸土霉素純品對斑馬魚的急性毒性及氧化應(yīng)激的影響，發(fā)現(xiàn)該土霉素純品為低毒物質(zhì)。

目前，關(guān)于土霉素對水生生物的毒性研究主要集中在土霉素純品，對土霉素廢水的毒性效應(yīng)研究相對匱乏，研究處理后的土霉素廢水對斑馬魚的毒性效應(yīng)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。筆者通過暴露實(shí)驗(yàn)，檢測斑馬魚的抗氧化酶活性、MDA含量和DNA損傷，明確處理后的土霉素廢水對水生生物的毒性，并為進(jìn)一步研究土霉素在水環(huán)境中的生態(tài)毒性效應(yīng)提供科學(xué)根據(jù)。

1材料與方法

1.1主要儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)（UV-2550，日本島津公司）;酶標(biāo)儀（SpectraMax190，美國美谷分子儀器有限公司）;高速離心機(jī)（TG16-WS，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）;水浴鍋（DK-S26，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;漩渦混合器（XW-80A，上海米青科實(shí)業(yè)有限公司）;高純水蒸餾器（SYZ-A，江蘇金壇市宏華儀器廠）;溶解氧測定儀（JPBJ-608，上海精密科學(xué)儀器有限公司）;酸度計(jì)（FE20，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;低溫冰箱（海爾BBC-226STV）;分析天平（EL204，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;水硬度計(jì)（YD300）等。

1.2水樣和試劑

土霉素廢水，取自某藥廠污水處理廠二沉池出水。

考馬斯亮蘭，MDA，SOD，POD試劑盒，均從南京建成生物研究所購買;磷酸化組蛋白H2AX（γ-H2AX）試劑盒，從上?？ㄅ锟萍加邢薰举徺I;pH值為7.4的磷酸緩沖溶液（PBS），購買于試劑公司自行調(diào)試;0.9%生理鹽水，購自河北省水利醫(yī)院;冰乙酸、無水乙醇，兩者均為分析純。

1.3受試生物

選用斑馬魚（Danio rerio）為受試生物，購買于上海博舜生物科技有限公司。斑馬魚體長為（2505±040）mm，體重（0.20±0.05）g，選擇同批次、規(guī)格整齊、體色光澤、魚鰭完整舒展的斑馬魚。將斑馬魚采用5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的食鹽水進(jìn)行消毒處理后送入實(shí)驗(yàn)室，之后放入48 h曝氣的脫氯自來水中馴養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)用水符合GB 11607—1989《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》，整個(gè)馴養(yǎng)過程中斑馬魚的死亡率小于5%。實(shí)驗(yàn)前24 h對斑馬魚停止喂食，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間也不喂食。

1.4方法

根據(jù)《水和廢水監(jiān)測分析方法》中的魚類毒性實(shí)驗(yàn)方法開展土霉素廢水對斑馬魚的預(yù)實(shí)驗(yàn)[13]。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，斑馬魚暴露于100%體積濃度的土霉素廢水96 h后無死亡現(xiàn)象。因此，預(yù)實(shí)驗(yàn)沒有獲得土霉素廢水對斑馬魚的24 h絕對致死濃度（24 h LC100）和96 h的無死亡濃度（96 h LC0）。根據(jù)中國魚類急性毒性實(shí)驗(yàn)的分級標(biāo)準(zhǔn)，確定土霉素廢水對斑馬魚屬于低毒物質(zhì)，可直接進(jìn)行亞急性毒性實(shí)驗(yàn)。

采用浸浴染毒法[14]進(jìn)行亞急性毒性實(shí)驗(yàn)，設(shè)定20%，40%，60%，80% 4個(gè)體積濃度組和一個(gè)空白對照組，每組體積濃度設(shè)置3個(gè)平行，土霉素廢水用脫氯自來水進(jìn)行稀釋，配成不同體積濃度的實(shí)驗(yàn)溶液。在5 L玻璃魚缸中分別加入4 L實(shí)驗(yàn)溶液，將在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)7 d以上的斑馬魚放入各濃度組中，每組投放25尾斑馬魚，暴露15 d，每 3 d測一次生化指標(biāo)。

1）實(shí)驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)溶液pH值維持在7.4～7.6，水溫控制在（22±1）℃，總硬度為100 mg/L;溶解氧含量不小于5 mg/L。實(shí)驗(yàn)期間須連續(xù)曝氣，并進(jìn)行遮光處理，為了保證廢水的體積濃度一致，每隔24 h更換實(shí)驗(yàn)溶液1次;每天測定1次水溫、pH值、硬度及溶解氧含量等實(shí)驗(yàn)溶液的基本指標(biāo)。

2）樣品處理

每次測試前從相應(yīng)體積濃度組中取3條實(shí)驗(yàn)魚，快速解剖并取肌肉組織（0.1～0.2 g），在預(yù)冷的0.86%生理鹽水中進(jìn)行漂洗，用濾紙拭干，準(zhǔn)確稱量待測組織質(zhì)量后放入勻漿器中。用移液器按1∶9（質(zhì)量體積比，g∶mL）量取預(yù)冷的0.86%的生理鹽水置于勻漿器中，充分勻漿8 min，整個(gè)勻漿過程在冰水浴中進(jìn)行。待組織勻漿充分研碎后，用高速冷凍離心機(jī)以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液待測。其中進(jìn)行γ-H2AX樣本處理時(shí)只需將生理鹽水替換為pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）。

3）測試方法

SOD采用黃嘌呤氧化酶法測定，POD采用愈創(chuàng)木酚比色法測定，MDA采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定，γ-H2AX采用雙抗體夾心法測定。

4）統(tǒng)計(jì)結(jié)果

統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）表示，用SPSS22對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用最小顯著差數(shù)法（LSD）對同一天內(nèi)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析。0.01

2結(jié)果與討論

2.1土霉素廢水對斑馬魚肌肉組織SOD活性和POD活性的影響

SOD是生物體內(nèi)一種保護(hù)性酶，具有清除體內(nèi)自由基、控制脂質(zhì)過氧化及減輕膜氧化損傷的作用[15-16]。土霉素廢水對斑馬魚肌肉組織SOD活性的影響見圖1 a）。由圖1 a）可以看出，第3 d時(shí)，4個(gè)體積濃度組SOD活性均受到抑制，20%和40%體積濃度組的SOD活性分別達(dá)到了實(shí)驗(yàn)期間的最小值（40.95 U/mg prot，37.10 U/mg prot）。這可能是由于暴露起初魚體因外來物質(zhì)的進(jìn)入，斑馬魚機(jī)體用于抵抗土霉素廢水脅迫而產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基（O2-），過量的O2-消耗了大量的SOD，使得SOD活性降低，或者自由基抑制圖1土霉素廢水對斑馬魚肌肉組織SOD和POD活性的影響

Fig.1Effects of pharmaceutical sewage on SOD activity and POD activity of zebrafish muscle tissue

了機(jī)體SOD的酶活性，SOD因合成受阻導(dǎo)致活性降低[17]。沈洪艷等[18]在研究頭孢噻肟鈉對斑馬魚SOD活性、MDA含量及DNA損傷的影響中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)第3 d暴露組均受到了抑制;第6 d，抑制水平有所緩解，這可能是斑馬魚機(jī)體正在適應(yīng)土霉素廢水的環(huán)境，并且此時(shí)斑馬魚體內(nèi)其他的氧化酶（如GSH等）可能發(fā)揮著作用;第9 d，60%體積濃度組受到了顯著抑制（0.01

POD是一類氧化還原酶，具有清除過氧化氫、酚類、胺類和醛類的作用。土霉素廢水對斑馬魚肌肉組織的POD活性影響見圖1 b）。由圖1 b）可以看出，暴露第3 d，不同體積濃度組的POD活性均低于對照組，4個(gè)體積濃度組的POD活性均為極顯著抑制（P<0.01），這可能是由于暴露初期土霉素廢水誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基或在SOD酶的作用下生成過氧化氫，而POD有催化、清除過氧化氫和有機(jī)過氧化物的作用[21]，從而使機(jī)體內(nèi)POD及其同工酶消耗，導(dǎo)致POD活性降低，各組反應(yīng)一致表明了魚體POD遇到氧化脅迫就會啟動反應(yīng)機(jī)制。第6 d，60%體積濃度組的POD活性高于對照組，其他暴露組POD活性均低于對照組，但無顯著性抑制，這可能是外源污染物隨著暴露時(shí)間的延長對機(jī)體產(chǎn)生了輕微刺激，機(jī)體POD酶增加以清除體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，H2O2和O2-等分解成沒有毒性的小分子物質(zhì)，減輕對細(xì)胞的損傷，防止活性氧自由基啟動膜脂過氧化作用來保護(hù)細(xì)胞生物膜不被破壞[22]。第9 d，4個(gè)暴露組POD活性與對照組相比均表現(xiàn)出輕微的抑制作用，說明機(jī)體中POD酶仍對H2O2和O2-發(fā)生著消除反應(yīng)。第12 d，20%和40%體積濃度組與空白對照組相比無明顯差異（P>0.05），可能是在低體積濃度暴露組中，機(jī)體能夠較為正常地產(chǎn)生POD酶用來消除外來物質(zhì)的影響;60%體積濃度組與對照組相比，受到了極顯著性誘導(dǎo)（P<0.01），達(dá)到了實(shí)驗(yàn)期間的最大值（2.72 U/mg prot），這可能是由于暴露進(jìn)入魚體內(nèi)的外源污染物達(dá)到了一定水平，機(jī)體需要產(chǎn)生更多的POD消耗底物的活性氧自由基。第15 d，各暴露組POD活性均低于空白對照組，20%，40%和80%體積濃度組出現(xiàn)了顯著性抑制（0.01

2.2土霉素廢水對斑馬魚肌肉組織MDA含量的影響（圖2）

MDA是生物膜中的不飽和脂肪酸在自由基作用下生成的一種脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物[25]。由圖2可以看出，第3 d，與對照組相比，暴露組的MDA含量受到不同程度的抑制作用，這可能是因?yàn)轸~體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)成分（SOD，POD，GSH，GST）的參與，較大限度地降低了機(jī)體活性氧濃度。第6 d，暴露組MDA含量與對照組相比，無顯著差異（P>0.05）。第9～15 d，與相應(yīng)對照組相比，暴露組MDA含量均出現(xiàn)極顯著性誘導(dǎo)（P<0.01），暴露組MDA含量均有很大程度的升高。這可能是由于土霉素廢水已經(jīng)進(jìn)入斑馬魚肌肉組織內(nèi)，造成機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，發(fā)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物[26]。第9 d，20%體積濃度組達(dá)到最大值（4.57 nmol/mg prot）。第12 d，60%體積濃度組達(dá)到實(shí)驗(yàn)最大值（5.09 nmol/mg prot）。馮濤等[27]也發(fā)現(xiàn)苯并（a）芘對大彈涂魚肝臟的暴露時(shí)間和濃度均對MDA濃度有顯著影響。第15 d，與對照組相比，各暴露組同樣受到極顯著性誘導(dǎo)（P<0.01），并且80%體積濃度組達(dá)到實(shí)驗(yàn)最大值（5.41 nmol/mg prot），這說明魚體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)已經(jīng)遭受到較大程度的損傷，使得氧自由基增多，與不飽和脂肪酸結(jié)合引起脂質(zhì)過氧化過程，MDA含量增多卻得不到消解，最終導(dǎo)致膜系統(tǒng)嚴(yán)重受損。沈洪艷等[28]也發(fā)現(xiàn)高濃度的鏈霉素廢水對斑馬魚產(chǎn)生了嚴(yán)重的氧化損傷。整體來看，各暴露組在不同時(shí)間段MDA含量整體呈“Λ”型變化趨勢。

2.3土霉素廢水對斑馬魚肌肉組織中DNA的損傷

人們普遍認(rèn)為DNA雙鏈斷裂（double stranded breaks，DSBs）是最嚴(yán)重的DNA損傷，無論何種因素造成DSBs，H2AX都會被誘導(dǎo)磷酸化為γ-H2AX與簇集[29]，因此γ-H2AX含量可以成為檢測細(xì)胞DNA損傷的一個(gè)特異指標(biāo)。土霉素廢水對斑馬魚肌肉組織γ-H2AX含量的影響見圖3。由圖3可以看出，第3 d，暴露組γ-H2AX含量均低于對照組，說明在暴露初期土霉素廢水就已經(jīng)對斑馬魚肌肉組織（SOD活性、MDA含量）產(chǎn)生了一定的機(jī)體損傷，正常的H2AX磷酸化（γ-H2AX）并未及時(shí)形成，導(dǎo)致γ-H2AX含量降低[30]。第6 d，除了20%體積濃度組低于對照組外，其他暴露組γ-H2AX含量均大于對照組，并且40%體積濃度組受到極顯著性差異（P<0.01），60%體積濃度組受到顯著性差異（0.01

2.4指標(biāo)關(guān)系分析

system index機(jī)體抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)機(jī)理見圖4。當(dāng)機(jī)體受到外來污染物攻擊時(shí)，會發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量活性氧自由基，活性氧就有可能對DNA造成損傷或脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生新的氧化自由基醛基（MDA）對機(jī)體造成傷害。SOD和POD屬于抗氧化酶，當(dāng)機(jī)體活性氧自由基過多時(shí)，為了避免機(jī)體損傷，活性氧自由基可以被SOD催化發(fā)生歧化反應(yīng)生成過氧化物。過氧化物（如H2O2）對機(jī)體同樣具有一定傷害，又會被POD及其同工酶進(jìn)一步分解成無傷害的小分子物質(zhì)。從圖1可以看出，SOD與POD各濃度組隨著時(shí)間均呈“抑制—誘導(dǎo)—抑制”的變化趨勢，因此具有一定的正相關(guān)。由于POD存在多種同工酶，所以POD的變化趨勢更趨于穩(wěn)定。當(dāng)過量的ROS無法被SOD消除時(shí)，就會直接造成DNA損傷，DNA遭到損傷又會反過來阻礙SOD的合成。由圖1 a）和圖3可以看出，隨著暴露時(shí)間的增加，高濃度組DNA受到了一定程度的損傷，在第12 d，80%體積濃度組的SOD活性受到極顯著抑制，被認(rèn)為是由于DNA損傷，阻礙了SOD合成而造成的。當(dāng)SOD活性遭到抑制或由于DNA受損阻礙SOD合成時(shí)，活性氧就會脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生氧化自由基醛基（MDA），MDA是氧化損傷最終形成的脂質(zhì)過氧化物。從圖1和圖2可以看出，與對照組相比，高濃度暴露組SOD與POD的活性隨著暴露時(shí)間的增加主要呈現(xiàn)抑制作用，與此相反，暴露組MDA與其對照組相比，主要呈現(xiàn)出誘導(dǎo)作用。因此，SOD和POD與MDA具有一定的負(fù)相關(guān)，MDA含量可以間接指示機(jī)體自由基水平，并且是毒性作用和保護(hù)作用的綜合反映[34]。從酶系間的變化差異而言，POD變化趨勢比SOD更趨于穩(wěn)定，規(guī)律性更強(qiáng)。但在對濃度的敏感性方面，從圖1可知，SOD更優(yōu)于POD，POD在濃度組間無明顯變化趨勢。從對機(jī)體損傷方面的指標(biāo)變化差異而言，土霉素廢水脅迫產(chǎn)生自由基水導(dǎo)致的DSBs修復(fù)完成后，γ-H2AX去磷酸化恢復(fù)為H2AX，MDA含量比γ-H2AX含量更為明顯地指示機(jī)體自由基水平，γ-H2AX含量則能夠明顯反映細(xì)胞DNA的受損情況。

3結(jié)論

1） 對斑馬魚而言，處理后體積分?jǐn)?shù)為20%，40%，60%和80%的土霉素廢水屬于低毒物質(zhì)。

2） 處理后體積分?jǐn)?shù)為20%，40%，60%和80%的土霉素廢水對斑馬魚肌肉組織中的SOD活性、POD活性和MDA含量影響顯著：前中期（3～9 d）土霉素廢水對斑馬魚SOD活性和POD活性主要為抑制作用，后期（12～15 d）主要為誘導(dǎo)作用;土霉素廢水對斑馬魚MDA含量主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用，其破壞了機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，造成了一定的氧化損傷，但損傷程度在機(jī)體的防御范圍之內(nèi)。

3） 處理后體積分?jǐn)?shù)為80%的土霉素廢水，對斑馬魚肌肉組織存在較大的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。

4） 處理后體積分?jǐn)?shù)為20%，40%，60%和80%的土霉素廢水脅迫斑馬魚產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)，可能是導(dǎo)致DNA損傷的重要機(jī)制之一。

5） 土霉素廢水成分復(fù)雜，因此需對土霉素廢水的主要成分及各成分作用產(chǎn)生的毒性效應(yīng)進(jìn)行更為深入的研究。

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