基于ISSR標(biāo)記的咖啡資源遺傳多樣性分析

閆林 黃麗芳 王曉陽(yáng) 周華 程金煥 李錦紅

摘? 要? 采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)87份咖啡資源進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析。結(jié)果表明，19條ISSR引物擴(kuò)增出140條帶，其中多態(tài)性帶107條，多態(tài)性位點(diǎn)為76.4%。運(yùn)用UPGMA方法構(gòu)建了聚類(lèi)圖，在遺傳相似系數(shù)0.625水平下，87份資源被分為3大類(lèi)。第Ⅰ類(lèi)群包括了3份大粒種（Coffea liberica Bull ex Hiern）;第Ⅱ類(lèi)群為中粒種咖啡（C. canephora Pierre）;第Ⅲ類(lèi)群包括了全部小粒種資源（C. arabica Linne），共83份。咖啡種質(zhì)的遺傳關(guān)系種間容易劃分，在種的分類(lèi)水平上存在遺傳關(guān)系多樣性，而小粒種咖啡種內(nèi)遺傳多樣性較窄。該研究結(jié)果將為咖啡種質(zhì)鑒定、分類(lèi)及分子育種提供重要科學(xué)依據(jù)。表明用ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行咖啡資源遺傳多樣性的分析是可行的。

關(guān)鍵詞? 咖啡;ISSR;聚類(lèi)分析;遺傳多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)? S571.2? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

咖啡（Coffea spp.）為茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）多年生常綠灌木或小喬木?？Х葘俚姆N類(lèi)約有124種，主要分布在世界熱帶和亞熱帶地區(qū)[1-2]。商業(yè)栽培的主要有阿拉比卡中咖啡（Coffea arabica L.，俗稱(chēng)小粒種咖啡）和羅布斯塔咖啡（Coffea Canephora Pierre，俗稱(chēng)中粒種咖啡）。小粒種咖啡是咖啡屬中唯一的同源四倍體物種（2n=4x=44），其余的均是二倍體[3-4]。小粒種咖啡是中粒種咖啡和C. eugenoedes或其他生態(tài)型較近的二倍體雜交后代，原產(chǎn)于埃塞俄比亞中部高原[5-7]。

ISSR（inter simple sequence repeat）分子標(biāo)記是一種以微衛(wèi)星序列為引物，進(jìn)行多位點(diǎn)PCR擴(kuò)增的技術(shù)，ISSR不僅有豐富的多態(tài)性，同時(shí)具有簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定的特點(diǎn)，廣泛地應(yīng)用于生物的品鑒定[8]、遺傳多樣性分析[9]、遺傳圖譜構(gòu)建[10]、基因定位[11]等方面的研究。在咖啡種質(zhì)資源鑒定方面也有所應(yīng)用。Ruas等[12]利用ISSR標(biāo)記對(duì)8個(gè)咖啡種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明種間遺傳差異較大，遺傳相似數(shù)變幅很大，從racemosa咖啡與大粒種咖啡相似數(shù)0.25到阿拉比卡咖啡與N2雜交種的0.86。Aga等[13]利用ISSR標(biāo)記對(duì)來(lái)源于埃塞俄比亞4個(gè)地區(qū)的森林咖啡進(jìn)行了遺傳差異分析，11個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增出123條帶，其中25%具有多態(tài)性。盡管ISSR標(biāo)記檢測(cè)到的多態(tài)性位點(diǎn)較少，但仍可作為小粒種咖啡群體的特征性分子標(biāo)記。ISSR標(biāo)記也被用于評(píng)價(jià)來(lái)自坦桑尼亞小粒種咖啡種內(nèi)的遺傳差異，并計(jì)算了小粒種咖啡與二倍體咖啡間的遺傳相似指數(shù)[14]。利用ISSR標(biāo)記對(duì)來(lái)自印度的4個(gè)Psilanthus種和來(lái)自非洲的15個(gè)咖啡種進(jìn)行分析，這2種標(biāo)記均表明在印度Psilanthus種和非洲咖啡間存在明顯差異[15]。ISSR標(biāo)記也更有效的揭示了DRC組織中粒種咖啡內(nèi)存在遺傳變異[16]。Kassahun等[17]利用9個(gè)ISSR標(biāo)記分析了來(lái)自埃塞俄比亞的125份野生種和地方品種，鑒別了野生咖啡與地方品種的區(qū)別，并認(rèn)為小粒種咖啡在異源多倍體化后，由于最近或古老的基因流動(dòng)，從逐步延伸的范圍延伸出來(lái)的野生咖啡基因型的分級(jí)地理模式被模糊了。

我國(guó)引種咖啡100多年，收集保存了大量種質(zhì)資源，前期也開(kāi)展了資源鑒定評(píng)價(jià)，但主要集中于表型鑒定評(píng)價(jià)研究[18]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，借助分子技術(shù)進(jìn)行鑒定評(píng)價(jià)是最為可靠而快捷的方法。黃麗芳等[19-22]利用RAPD技術(shù)分析了我國(guó)咖啡資源的多樣性，明確了其親緣關(guān)系，表明該標(biāo)記可以用于咖啡種質(zhì)的鑒別。國(guó)外已有利用ISSR標(biāo)記進(jìn)行咖啡資源遺傳多樣性分析的研究，但對(duì)于我國(guó)收集保存的咖啡資源還未見(jiàn)報(bào)道，而且我國(guó)收集保存了來(lái)源于世界20多個(gè)國(guó)家的咖啡資源，其親緣關(guān)系如何、遺傳多樣性是否豐富還未能明確，不利于后續(xù)的資源評(píng)價(jià)與創(chuàng)新利用工作。因此，本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)云南收集保存的來(lái)自不同國(guó)家的87份資源進(jìn)行多樣性分析，旨在揭示其親緣關(guān)系，從而為咖啡種質(zhì)資源的收集、鑒定、資源保護(hù)和遺傳育種提供科學(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試材料為87份咖啡種質(zhì)資源（表 1），分別來(lái)源于中國(guó)、葡萄牙、墨西哥、肯尼亞等22個(gè)國(guó)家，其中小粒種83份，中粒種1份，大粒種3份。編號(hào)1-63取自云南德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所瑞麗咖啡種質(zhì)資源圃（云南德宏），編號(hào)64-70取自云南省普洱市，編號(hào)71-87取自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物研究所（云南保山）。

1.2? 方法

1.2.1? 基因組DNA的提取? 基因組DNA的提取參照黃麗芳等[23]的CTAB改良法。提取的基因組DNA經(jīng)1.0% 瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)量，稀釋至20 ng/μL，備用。

1.2.2? ISSR-PCR擴(kuò)增及引物篩選? ISSR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照閆林等[24]的方法。PCR 產(chǎn)物加入3 μL溴酚藍(lán)緩沖液，通過(guò)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳觀察。

ISSR所用引物為加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC Primer Set #9）公布的100個(gè)引物序列，以4份差異較大的咖啡（27號(hào)、臺(tái)灣小粒、大粒、M10）基因組DNA為模板，按照優(yōu)化的反應(yīng)條件篩選多態(tài)性好且擴(kuò)增條帶清晰的引物19條用于本試驗(yàn)（表2）。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中遷移率，對(duì)電泳結(jié)果統(tǒng)計(jì)。按照有（1）和無(wú)（0）記錄譜帶，重復(fù)性、清晰度好的擴(kuò)增條帶賦值“1”，無(wú)條賦值“0”，構(gòu)建原始數(shù)據(jù)矩陣。采用NTSYSpc 2.1軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析，計(jì)算遺傳相似系數(shù)GS（genetic similarity），采用非加權(quán)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性

利用4份（27號(hào)、臺(tái)灣小粒、大粒、M10）差異較大的咖啡樣本擴(kuò)增，從100條ISSR引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性高的引物19條。利用篩選出的19條引物對(duì)87份樣品進(jìn)行多樣性分析（圖1），共檢測(cè)到140個(gè)位點(diǎn)，不同引物擴(kuò)增帶數(shù)3～13條不等，平均每條引物擴(kuò)增7.4條帶，DNA片段大小分布在170～2100 bp。多態(tài)性位點(diǎn)107條，占總條帶的76.4%，多態(tài)性條帶數(shù)量在1～11條。

2.2? 遺傳相似系數(shù)

應(yīng)用NTSYS軟件計(jì)算87份咖啡材料間遺傳相似系數(shù)（GS），得到相似性矩陣（表3）。87份材料間的遺傳相似系數(shù)為0.430～0.991，平均值為0.689。根據(jù)遺傳相似系數(shù)可判斷不同種質(zhì)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，從表3可以看出，所有種質(zhì)間均存在不同程度的遺傳差異。夏威夷-1（大葉）與夏威夷-2遺傳相似系數(shù)最大，為0.991，表明遺傳距離最近，遺傳差異最小;大粒種-1與P2、危地馬拉、坦桑尼亞遺傳相似系數(shù)均最小，為0.430，表明遺傳距離最遠(yuǎn)，遺傳差異最大。

2.3? 聚類(lèi)分析

采用UPGMA進(jìn)一步對(duì)87份咖啡材料進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖2）。在遺傳相似系數(shù)0.625水平下，可把87份資源分為3大類(lèi)。第Ⅰ類(lèi)群包括3份大粒種，在0.786處，采集自熱經(jīng)所的2份大粒種又聚為一類(lèi)，說(shuō)明二者親緣關(guān)系更近;第Ⅱ類(lèi)群為1份種質(zhì)，為來(lái)自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物研究所的中粒種咖啡;第Ⅲ類(lèi)群包括了來(lái)自哥倫比亞、葡萄牙、巴西、墨西哥、中國(guó)云南等21個(gè)國(guó)家及地區(qū)的83份小粒種咖啡。

似系數(shù)在0.666～0.991之間，說(shuō)明小粒種咖啡種質(zhì)間親緣關(guān)系較近，遺傳距離小;在相似系數(shù)0.714處，又可分為3個(gè)分支，其中一支為雜交種和矮卡2，一支為德熱132、巴西2、巴西3共3份資源，剩余的來(lái)自巴西、墨西哥、哥倫比亞等地共78份種質(zhì)聚為一類(lèi)。

2.4? 主坐標(biāo)分析

通過(guò)對(duì)87份咖啡資源的ISSR數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行主坐標(biāo)分析，以排在前3位的矩陣特征值為坐標(biāo)，制成三維分布圖（圖3）。各特征值的貢獻(xiàn)指數(shù)分別占48.92%、16.57%、14.43%，累計(jì)貢獻(xiàn)指數(shù)為79.93%。不同維度上種質(zhì)距離的大小代表著種質(zhì)間的疏密程度，進(jìn)而揭示種質(zhì)間的親緣關(guān)系[25]。圖中展示出通過(guò)主坐標(biāo)將87份種質(zhì)分為3大組，表明能夠聚集在一起的各組種質(zhì)間遺傳關(guān)系更近，且主坐標(biāo)分析與系統(tǒng)聚類(lèi)分析結(jié)果一致。

3? 討論

種質(zhì)資源遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ)，所有的遺傳多樣性都是發(fā)生在基因水平，遺傳變異的產(chǎn)生，形成了豐富的遺傳多樣性[26-27]。有效的收集、保存、評(píng)價(jià)和利用咖啡種質(zhì)資源對(duì)于咖啡產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展具有重要的意義。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，咖啡資源的準(zhǔn)確鑒定和相關(guān)研究的進(jìn)一步深化。相似系數(shù)是描述2個(gè)指標(biāo)或2個(gè)樣品間相似程度的度量參數(shù)，相似系數(shù)越大，材料間相似程度就越高，遺傳背景一致性也就越強(qiáng)。本研究通過(guò)Nei-Li相似系數(shù)法計(jì)算出87份咖啡材料的遺傳系數(shù)為0.430～0.991，平均遺傳相似系數(shù)為0.689，表明不同咖啡材料間存在著豐富的多態(tài)性。在0.625水平下，可將87份咖啡資源分為3大類(lèi)，ISSR標(biāo)記可為咖啡種質(zhì)的分類(lèi)研究提供更多的信息。83份小粒種咖啡資源都聚在第Ⅲ類(lèi)群，遺傳相似性系數(shù)0.666～0.991，遺傳相似系數(shù)較高，這與小粒種咖啡為自花授粉有關(guān)，所以種內(nèi)遺傳親緣關(guān)系較近，具有相對(duì)較高的遺傳一致性。Anthony等[5]利用AFLP和SSR分析小粒種野生與栽培種資源，半野生小粒種的多態(tài)性比栽培種高，但整體小粒種遺傳多樣性不明顯。Ma sum buko等[28]研究結(jié)果表明栽培小粒種咖啡資源親緣關(guān)系較近，遺傳差異小。黃麗芳等[20]利用RAPD對(duì)我國(guó)收集保存的咖啡資源進(jìn)行分析，結(jié)果也表明小粒種咖啡資源遺傳多樣性較窄，這些與本試驗(yàn)的結(jié)果較一致。這一方面與小粒種咖啡為自花授粉作物有關(guān)，另一方面也與我國(guó)現(xiàn)有小粒種咖啡種質(zhì)資源大多為國(guó)外引進(jìn)的栽培種，而野生種質(zhì)引進(jìn)較少有關(guān)，而且這些外引品種的育種親本范圍較為狹窄。

種質(zhì)資源的遺傳關(guān)系相似程度與資源來(lái)源地和栽培環(huán)境具有一定的相關(guān)性[29-31]。小粒種資源小葉夏威夷-1、大葉夏威夷-1和夏威夷-2，CATMOR P90、CATIMOR P127、CATMOR P128、CATIMOR P134、CATIMOR P130，哥斯達(dá)黎加-1、哥斯達(dá)黎加-3、哥斯達(dá)黎加-4，巴西-2和巴西-3及2份云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物研究所的大粒種資源等部分來(lái)源相近的種質(zhì)間表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。但也有資源偏離所屬?lài)?guó)家（地區(qū)）的現(xiàn)象，如來(lái)自肯尼亞的CATIMOR P88、CATIMOR P129分別與其他資源聚為2個(gè)分支，哥斯達(dá)黎加-2與其他資源聚為一個(gè)分支，說(shuō)明同一地區(qū)的種質(zhì)間存在遺傳差異，這可能與廣泛的種質(zhì)起源以及漫長(zhǎng)的進(jìn)化有關(guān)，也可能是長(zhǎng)期人工選育的結(jié)果。

咖啡種質(zhì)資源創(chuàng)新利用的最終目的是培育優(yōu)良新品種，提高咖啡的產(chǎn)量、品質(zhì)，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。明確咖啡種質(zhì)資源的親緣關(guān)系是資源利用的基礎(chǔ)。本研究通過(guò)ISSR標(biāo)記分析結(jié)果表明，87份咖啡種質(zhì)資源存在遺傳關(guān)系多樣性，在種的分類(lèi)水平上存在遺傳差異，而在小粒種咖啡種內(nèi)遺傳多樣性較窄。該研究結(jié)果將為咖啡種質(zhì)鑒定、分類(lèi)及分子育種提供重要科學(xué)依據(jù)。ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行咖啡資源遺傳多樣性的分析是可行的。

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