內(nèi)源H2O2對水稻種子萌發(fā)的影響

肖羽 馮紅玉 陳惠萍

摘? 要? 通過用不同濃度的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH）合成酶抑制劑碘二苯（diphenylene iodonium， DPI）及過氧化氫（hydrogen peroxide， H2O2）清除劑二甲基硫脲（dimethylthiourea， DMTU）分別培養(yǎng)水稻（Oryza sativa L.）種子，研究內(nèi)源H2O2對種子萌發(fā)過程胚根、胚芽和胚根根尖活力等的影響。結(jié)果表明，DPI及DMTU培養(yǎng)的水稻種子其胚根生長和胚芽生長均受到抑制，尤其是DPI對胚根生長的抑制作用更為顯著。DPI和DMTU對水稻種子萌發(fā)的影響均呈現(xiàn)出濃度效應，即濃度越高，抑制作用越強。其中，DPI對水稻種子萌發(fā)的抑制作用比DMTU的更為明顯。此外，胚根根尖的超氧陰離子（superoxide anion， O2）和H2O2含量隨DMTU濃度增大而減少，根尖細胞受損也越嚴重。由此推測，內(nèi)源H2O2可能參與調(diào)控水稻種子萌發(fā)過程。

關(guān)鍵詞? 內(nèi)源H2O2;種子萌發(fā);DPI;DMTU

中圖分類號? S511? ? ?文獻標識碼? A

種子萌發(fā)是指具有生活力的種子吸水膨脹后，胚根突破種皮的過程[1]。種子能否正常萌發(fā)對其后期是否能夠正常生長發(fā)育，以及正常結(jié)實具有重要的作用。種子萌發(fā)受到外部和內(nèi)部因素雙重影響，外部因素主要包括光照、溫度、水分等;內(nèi)部主要受到自身基因、激素及活性氧等影響。

過氧化氫（hydrogen peroxide， H2O2）是植物正常生理過程產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，早先被認為僅是具有毒害作用的活性氧[2]。但近年的研究發(fā)現(xiàn)，適當濃度的H2O2可作為逆境信號分子，參與調(diào)控植物的抗逆性[3-4]。已有研究證實，外源H2O2可以提高鋁脅迫下小麥根尖的抗氧化代謝水平，緩解鋁脅迫導致的氧化損傷，從而增強小麥對鋁脅迫的適應性[5]。適量的外源H2O2還可降低干旱下水稻糊粉層細胞內(nèi)H2O2的含量，延緩糊粉層細胞程序性死亡（programmed cell death， PCD）[6]，從而緩解干旱對水稻種子萌發(fā)的影響。

植物體內(nèi)H2O2主要是由NADPH合成酶途徑產(chǎn)生。碘二苯（diphenylene iodonium， DPI）作為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH）合成酶專一性抑制劑，預處理棉花種子會降低種子萌發(fā)率[7]。二甲基硫脲（dimethylthiourea， DMTU）是H2O2的清除劑，可降低H2O2含量，從而抑制萵苣種子萌發(fā)[8];DPI和DMTU均可減少干旱條件下水稻糊粉層中過量的H2O2，以提高淀粉酶活性，緩解干旱對水稻種子萌發(fā)的抑制作用[9]。DPI和DMTU還可降低中國石竹超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）和抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase， APX）活性[10]，影響山黎豆種子萌發(fā)和初生根生長[11]。

目前對于內(nèi)源H2O2影響正常生長條件下水稻種子萌發(fā)的研究仍較少，因此，本研究用不同濃度NADPH合成酶抑制劑DPI和H2O2清除劑DMTU處理水稻種子，闡明其胚根和胚芽生長等萌發(fā)狀況，并探究DMTU處理下胚根根尖超氧陰離子（superoxide anion， O2）含量和H2O2含量及細胞膜透性的變化，以期為進一步研究內(nèi)源H2O2調(diào)控水稻種子萌發(fā)的機理奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

實驗材料為水稻（Oryza sativa L.）雜交種‘博Ⅱ優(yōu)767種子，購自海南儋州種子站。選取均勻飽滿、大小一致、去除稻殼的種子50粒，放入墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，并于光照培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：光照周期16/8 h（晝/夜），光照強度400 μmol/（m2·s），溫度26 ℃。

1.2? 方法

1.2.1? 實驗處理? 實驗設(shè)為13個處理：分別包括水（CK）、DPI和DMTU。其中，DPI設(shè)置6個濃度，分別為10、20、30、40、50、60 μmol/L，同樣DMTU 也設(shè)置有6個濃度，包括10、20、30、40、50、60 mmol/L，每個處理設(shè)3次重復，每天更換對應的處理液。

1.2.2? 胚芽長、胚根長觀測及測量? 分別于培養(yǎng)的24 h及48 h觀測并拍照萌發(fā)水稻種子。培養(yǎng)3 d后，從每個處理中隨機選取10粒種子，純水洗凈并用濾紙吸干表面水分，用直尺測量胚根長和胚芽長。

1.2.3? 根系活性氧含量高低及質(zhì)膜透性大小觀察 參照氯化硝基四氮唑藍（nitrotetrazorium blue chloride， NBT）染色法[12]觀察水稻種子胚根根尖O2含量。分別從各處理中隨機選取培養(yǎng)3 d的萌發(fā)水稻種子，用手術(shù)刀切取根尖放入NBT染液（1 mmol/L，pH 5.8）中染色5 min，用純水多次沖洗根尖，洗凈后觀察。

參照二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine， DAB）染色法[13]觀察水稻種子胚根根尖H2O2含量。同樣隨機選取培養(yǎng)3 d的萌發(fā)水稻種子，切取根尖于二氨基聯(lián)苯胺染液（1 mg/mL，pH 5.8）中染色30 min后，用純水洗凈、觀察。

參照伊文思藍染色法[14]觀察質(zhì)膜透性大小。將萌發(fā)3 d水稻種子根尖放入0.125%伊文思藍染液染色5 min后，取出用蒸餾水洗凈觀察。

以上水稻種子胚根根尖染色后，均采用Olympus（SZX7）體式顯微鏡觀察并拍照。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行方差分析（analysis of variance， ANOVA），對處理間的差異性多重比較采用最小顯著性差異法（least significant difference， LSD）進行分析，用Excel和Photoshop軟件作圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? NADPH合成酶抑制劑DPI對水稻種子萌發(fā)中胚根生長和胚芽生長的影響

由圖1可見，在水培養(yǎng)24 h后，水稻種子的胚根和胚芽均突破了種皮，而不同濃度DPI培養(yǎng)24 h后，只有10 μmol/L處理的種子稍微露出胚根和胚芽，20、30 μmol/L處理的僅露出胚芽部分，其余處理的胚根和胚芽均未露出。浸種48 h后，水培養(yǎng)的胚根遠長于胚芽，10～30 μmol/L DPI處理的水稻種子僅露出一小段胚根，而40～60 μmol/L DPI處理的水稻種子則未見胚根露出。雖然不同濃度DPI處理下均可觀察到胚芽，但隨著DPI濃度的升高，胚芽長度逐漸縮短。以上結(jié)果表明，NADPH合成酶抑制劑DPI以依賴濃度效應影響水稻種子胚根及胚芽生長，且對胚根生長的影響效應遠大于對胚芽的影響。

由于DPI對胚根生長抑制較嚴重，致使培養(yǎng)3 d的水稻種子大部分未有胚根露出，因此，本研究僅對DPI處理的水稻種子胚芽長度進行測量。從圖2可知，與水培養(yǎng)的胚芽長度相比，不同濃度NADPH合成酶抑制劑DPI培養(yǎng)水稻種子3 d后，胚芽的長度受到明顯的抑制，抑制率均超過50%，且隨著處理濃度的遞增，胚芽長度顯著地遞減。

由此可見，因DPI減少了水稻種子內(nèi)由NADPH途徑產(chǎn)生的內(nèi)源H2O2，從而影響了水稻種子萌發(fā)過程胚根及胚芽的生長，尤其是嚴重抑制胚根的生長。這些結(jié)果表明了由NADPH途徑產(chǎn)生的內(nèi)源H2O2在調(diào)控水稻種子萌發(fā)中起著關(guān)鍵的作用。

2.2? H2O2清除劑DMTU對水稻種子萌發(fā)中胚根和胚芽生長的影響

如圖3所示，不同濃度DMTU培養(yǎng)水稻種子24 h后，其胚根全部突破種皮，其中10 mmol/L DMTU處理的胚根長度與正常處理的較為接近，20 mmol/L DMTU處理的胚根長度與30 mmol/L DMTU處理的也極為接近，且均明顯高于40～ 60 mmol/L DMTU處理的。同時，不同濃度DMTU處理的胚芽長度均明顯不如正常處理的，其中，60 mmol/L DMTU處理的胚芽仍未伸長，10～ 30 mmol/L DMTU處理的胚芽長度較為接近，40 mmol/L及50 mmol/L DMTU處理的胚芽僅露出一點。水稻種子經(jīng)過48 h培養(yǎng)后，10 mmol/L DMTU處理的胚芽及胚根長與正常處理的較為接近，20 mmol/L與30 mmol/L DMTU 處理的胚芽及胚根長度也較為接近，而50、60 mmol/L DMTU處理的胚根長度明顯不如其他濃度DMTU處理的。由此可見，水稻種子經(jīng)過不同濃度H2O2清除劑DMTU處理24 h或48 h后，萌發(fā)情況與DPI處理的相似，均呈現(xiàn)濃度效應，亦隨著DMTU濃度增大，對胚根及胚芽生長的抑制作用越大。

H2O2清除劑DMTU培養(yǎng)水稻種子3 d后，水稻種子胚根長隨著DMTU濃度依次遞增而逐漸降低，且降低的幅度較為平緩（圖4）。10 mmol/L DMTU處理的胚根長約為水處理胚根長的70%，從30 mmol/L開始，相鄰濃度間胚根長依次減少0.3 cm左右（p<0.05，圖4）。其中10 mmol/L DMTU處理的胚根長分別為40 mmol/L處理的2倍、50 mmol/L處理的3倍和60 mmol/L處理的5倍左右。

由圖5可見，10 mmol/L DMTU處理對胚芽生長影響較小，在處理水稻種子3 d后，其胚芽長度仍為正常處理的88%。20、30 mmol/L DMTU處理對胚芽長度的影響較為接近，僅相差0.1 cm，約為正常處理的70%～65%，這兩者間差異不顯著。與正常處理相比，40 mmol/L DMTU處理的胚芽長度被抑制了50%，50～60 mmol/L DMTU處理對胚芽長度的抑制極其顯著，其中60 mmol/L DMTU處理的胚芽長度僅為正常處理的30%（p<0.05）。

由此可見，清除種子內(nèi)H2O2抑制了水稻種子萌發(fā)過程胚根和胚芽的生長，從而影響種子的萌發(fā)，表明水稻種子的萌發(fā)需要種子內(nèi)一定量的H2O2參與。

2.3? H2O2清除劑DMTU對萌發(fā)水稻種子胚根根尖O2產(chǎn)生的影響

O2可與NBT反應生成藍紫色不溶于水的顯色物，其顏色深淺代表O2的含量高低，顏色越深，O2積累越多。由圖6可以看出，正常處理的胚根根尖顏色最深，即其O2含量最高;10 mmol/L DMTU處理的胚根根尖顏色僅次于正常處理的，20～ 40 mmol/L DMTU處理的胚根根尖顏色隨著濃度升高而變淺，表明O2含量隨濃度升高而減少;50、60 mmol/L DMTU處理的胚根根尖僅被輕微染色。因此，隨著H2O2清除劑DMTU濃度的升高，萌發(fā)水稻種子胚根根尖顏色逐漸變淺，即根尖O2含量隨之減少，呈現(xiàn)出一定的濃度效應。

2.4? H2O2清除劑DMTU對萌發(fā)水稻種子胚根根尖H2O2產(chǎn)生的影響

植物體內(nèi)H2O2被過氧化物酶分解后，可與DAB生成不溶于水的棕色產(chǎn)物，因此，根據(jù)顏色的深淺可以反映出細胞內(nèi)H2O2含量的高低，顏色越深，H2O2的含量就越高。如圖7所示，正常處理的萌發(fā)水稻種子胚根根尖染色最深，10 mmol/L DMTU處理的胚根根尖顏色比正常處理的的稍淺，說明10 mmol/L DMTU處理的胚根根尖H2O2含量與正常處理的較為接近，20、30 mmol/ L DMTU兩者處理的根尖顏色也比較接近，50 mmol/L DMTU處理的根尖只有輕微染色，

60 mmol/L DMTU處理的胚根根尖幾乎沒染上顏色。因此，隨著DMTU處理濃度越高，水稻種子胚根根尖染色越淺，且著色多集中于根尖前端，表明水稻種子胚根中H2O2含量與O2含量趨勢相同，H2O2清除劑DMTU濃度越大，H2O2含量與O2含量越少。

2.5? H2O2清除劑DMTU對萌發(fā)水稻種子胚根根尖細胞透性的影響

伊文思藍可進入細胞膜透性增大的細胞，藍色深淺代表根尖細胞膜透性大小，顏色越深，細胞膜透性越大，表明細胞受傷害程度越高。從圖8可見，隨著DMTU濃度逐漸增大，萌發(fā)水稻種子胚根根尖伊文思藍染色逐漸加深。正常處理的胚根根尖染色最淺，表明其細胞膜透性最小，細胞受傷害最輕;10～30 mmol/L DMTU處理的胚根根尖染色慢慢變深，即細胞膜透性逐漸增大;從40 mmol/L DMTU處理開始染色急劇加深，至60 mmol/L DMTU染色最深，說明此時細胞受傷害最嚴重。由此可見，隨著DMTU濃度增加，伊文思藍染色越來越深，表明胚根根尖細胞膜透性變大，即細胞受傷害程度逐漸增大，而根系活力逐漸變小，胚根正常生長受到一定的影響。

3? 討論

NADPH氧化酶存在于細胞質(zhì)膜上，通過將NADPH中的電子轉(zhuǎn)移給O2生成O2，然后由SOD將O2歧化成H2O2[3-4]。

在本研究中，不同濃度的NADPH氧化酶抑制劑DPI處理水稻種子后，其胚根長和胚芽長都受到明顯抑制，并呈現(xiàn)出濃度效應，即濃度越高，抑制效果越明顯。其中，20 μmol/L DPI處理的胚芽長度約為對照的45%左右，30～60 μmol/L DPI處理的胚根幾乎不生長。孔祥強等[7]研究表明，用DPI預處理棉花種子后，種子內(nèi)H2O2含量降低，萌發(fā)率也降低。此外，DPI處理綠豆幼苗外植體48 h后，不定根形成會完全被抑制，說明細胞中H2O2產(chǎn)生變少，導致綠豆不定根生長受阻[15]。本

研究結(jié)果顯示，DPI作為NADPH合成酶專一性抑制劑可抑制由NADPH途徑產(chǎn)生的內(nèi)源H2O2，進而阻礙水稻種子萌發(fā)及生長，尤其是胚根的生長。因此，我們推斷，由此產(chǎn)生的內(nèi)源H2O2與水稻胚根生長發(fā)育緊密相關(guān)，并且可能是調(diào)控水稻胚根生長與發(fā)育的重要因子。

在本研究中，水稻種子經(jīng)DMTU處理后，也呈現(xiàn)出濃度效應，即胚根及胚芽生長受到的抑制作用均隨DMTU濃度遞增而增強，且DMTU對胚根和胚芽的抑制作用相當。張鳳芝等[8]的研究也證實，萵苣種子經(jīng)DMTU處理后，因H2O2被清除，導致外源多鞍對種子萌發(fā)的促進作用降低，從而使種子萌發(fā)受到抑制。此外，對水稻種子胚根根尖染色觀察分析結(jié)果也表明，隨著DMTU濃度增大，H2O2含量及O2含量逐漸減少，而細胞膜透性卻逐漸增大，即胚根根尖細胞受傷害程度加深。林瑩等[16]研究與本研究結(jié)果相似，用NBT對大豆種子胚軸進行染色，正常種子萌發(fā)過程會產(chǎn)生O2，胚軸可被NBT完全染色，而老化的種子由于失去活力，萌發(fā)生長受到影響，導致O2產(chǎn)生較少，因此部分區(qū)域無染色。

在正常條件下，植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，因此，植物能維持正常生命活動，但一旦這種平衡被打破，其生命活動即受到影響。在本研究中，DPI和DMTU均顯著影響水稻種子胚根和胚芽的生長，并且DPI比DMTU對水稻種子萌發(fā)的抑制效果更顯著。張倩倩等[10]研究表明，DPI和DMTU有效地清除和減少正常條件下生長的石竹幼苗葉和根中O2和H2O2，并且這種效果在根中更為明顯，這與本實驗結(jié)論相一致。通過對本實驗結(jié)果進行分析，我們推測可能水稻種子正常萌發(fā)所需的內(nèi)源H2O2主要來自NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生的H2O2，而H2O2清除劑DMTU對水稻種子萌發(fā)的抑制效果不如DPI，可能是DMTU清除的H2O2中只有部分是來自由NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生的H2O2。本研究還證實DPI對水稻種子胚根的影響遠大于對胚芽的影響，說明NADPH產(chǎn)生的內(nèi)源H2O2主要是通過調(diào)控水稻種子胚根的發(fā)生來影響萌發(fā)。此外，DMTU因清除部分NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生的H2O2，因此，在一定程度阻礙了胚根及胚芽的生長，且胚根根尖O2含量和H2O2含量都有所減少，并引起根尖細胞損傷，從而使水稻種子的正常萌發(fā)受到影響。總之，維持內(nèi)源H2O2產(chǎn)生與清除動態(tài)平衡對水稻種子萌發(fā)及生長至關(guān)重要。

參考文獻

王? 瓊. 水稻種子萌發(fā)過程中RAmy1A基因的特異轉(zhuǎn)錄因子的篩選與鑒定[D]. 北京：中國科學院大學， 2016.

Larkindale J， Huang B. Thermotolerance and antioxidant systems in Agrostis stolonifera： involvement of salicylic acid， abscisic acid， calcium， hydrogen peroxide， and ethylene[J]. Journal of Plant Physiology， 2004， 161（4）： 405-413.

Neill S J， Desikan R， Clarke A， et al. Hydrogen peroxide and nitric oxide as signalling molecules in plants[J]. Journal of Experimental Botany， 2002， 53（372）： 1237-1247.

Hung S H. Hydrogen peroxide functions as a stress signal in plants[J]. Botanical Bulletin of Academia Sinica， 2005， 46（1）： 1-10.

徐芳杰. 過氧化氫作為信號分子在小麥耐鋁性中的作用及機理[D]. 杭州：浙江大學， 2011.

Wang G， Xiao Y， Deng X， et al. Exogenous hydrogen peroxide contributes to heme oxygenase-1 delaying programmed cell death in isolated aleurone layers of rice subjected to drought stress in a cGMP-dependent manner[J]. Frontiers in Plant Science， 2018， 9： 84.

孔祥強， 羅? 振， 張艷軍， 等. 過氧化氫預處理促進鹽脅迫下棉花種子萌發(fā)的效應[C]//全國棉花青年學術(shù)研討會， 2015.

張鳳芝， 胡文婷， 蘇國興. 多胺降解產(chǎn)生H2O2在萵苣種子萌發(fā)過程中的作用[J]. 蘇州大學學報（自然科學版）， 2011， 27（1）： 84-89.

王光輝. HO-1協(xié)同H2O2調(diào)控干旱誘導的水稻糊粉層PCD的發(fā)生[D]. 海口： 海南大學， 2014.

張倩倩， 蔚? 瀟， 賀學勤. 過氧化氫清除劑對H2O2處理下中國石竹幼苗不同器官抗氧化系統(tǒng)的影響[J]. 北方園藝， 2016（22）： 82-86.

蔣景龍. 外源過氧化氫抑制山黧豆種子萌發(fā)期初生根的向地性生長并誘導其發(fā)生水平彎曲[D]. 蘭州： 蘭州大學， 2012.

Lee S E， Shin H T， Hwang H J， et al. Antioxidant activity of extracts from Alpinia katsumadai seed[J]. Phytotherapy Research， 2003， 17（9）： 1041-1047.

Biondi S. Ectopic expression of maize polyamine oxidase and pea copper amine oxidase in the cell wall of tobacco plants[J]. Plant Physiology， 2004， 134（4）： 1414.

韓明明. 鎘鋅互作下H2O2對水稻根系生長發(fā)育的影響[D]. 淄博： 山東理工大學， 2011.

李師翁. H2O2在綠豆不定根形成與發(fā)育中的信號作用及其機理[D]. 蘭州： 蘭州大學， 2007.

林? 瑩. 老化大豆胚軸細胞死亡生物學基礎(chǔ)的研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2012.