云南甘蔗白條病的多基因聯(lián)合鑒定

張榮躍 李文鳳 王曉燕 單紅麗 倉曉燕

摘要甘蔗白條病是由白條黃單胞菌Xanthomonas albilineans （Ashby） Dowson引起的甘蔗重要病害。2017年在云南保山、孟定和金平蔗區(qū)的甘蔗上發(fā)現(xiàn)疑似白條病的病害。從病株蔗莖中分離得到圓形，凸面，光滑，有光澤，黃色的細(xì)菌菌落。經(jīng)柯赫氏法則驗證，分離得到的細(xì)菌為該病害的病原菌。使用16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因?qū)Ψ蛛x得到的病原菌進行了分子鑒定，BLAST和系統(tǒng)發(fā)育分析表明本研究所獲得的病原菌的3個基因的核苷酸序列與白條黃單胞菌GPE PC73菌株（GenBank登錄號： FP565176）對應(yīng)基因的核苷酸序列一致性均為100%，在系統(tǒng)發(fā)育樹中處于同一分支。根據(jù)田間癥狀診斷、柯赫氏法則驗證及分子鑒定結(jié)果，確認(rèn)云南保山、孟定和金平發(fā)生的甘蔗病害為X. albilineans引起的甘蔗白條病。

關(guān)鍵詞甘蔗白條病;白條黃單胞菌;系統(tǒng)發(fā)育分析;云南

中圖分類號：S 432.42

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018178

甘蔗白條病是由白條黃單胞菌Xanthomonas albilineans （Ashby） Dowson引起的甘蔗重要病害之一，其對甘蔗的危害是毀滅性的，常造成巨大的經(jīng)濟損失[12]。該病害于19世紀(jì)20年代在印度尼西亞爪哇島、澳大利亞和斐濟被首次報道，現(xiàn)已廣泛發(fā)生于美國、古巴、巴西、澳大利亞、法國、印度和巴基斯坦等40多個植蔗國家和地區(qū)[3]。2016年在我國廣西蔗區(qū)首次檢測到甘蔗白條病[4]。甘蔗白條病是一種細(xì)菌性維管束病害，可通過帶病蔗種進行遠(yuǎn)距離傳播，在田間還可通過刀具和收獲工具等機械傳播，也可通過氣流和雨水傳播，且傳播性極強[56]。X. albilineans目前仍是中國進境植物重要的檢疫對象之一[7]。

目前，除云南外，在廣西、廣東、海南、福建均發(fā)現(xiàn)了甘蔗白條病[8]。2017年在云南保山、孟定和金平蔗區(qū)的甘蔗上發(fā)現(xiàn)了疑似白條病的病害。為明確這些病害是否是由X. albilineans引起的甘蔗白條病，本文采用了病害田間癥狀觀察、柯赫氏法則驗證，同時結(jié)合16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因序列分析對病原進行了鑒定，旨在為該病害的防控和研究提供參考。

1材料與方法

1.1甘蔗白條病樣品

2017年從云南孟定、保山和金平蔗區(qū)采集18份疑似甘蔗白條病樣品，MD1S～MD7S來自孟定，品種為‘柳城031137;BSH1S～BSH5S來自保山，品種為‘桂糖081589;JP1S～JP6S 來自金平，品種為‘ROC1。

1.2病原分離培養(yǎng)及回接試驗

將蔗莖用無菌水清洗干凈，切成5～8 cm，使用75%乙醇溶液表面消毒20 s，然后點火將蔗莖表面乙醇溶液燒盡，連續(xù)進行2次。將蔗莖放入滅菌的50 mL離心管中，3 000 r/min離心10 min，吸取離心管底部蔗汁，使用1×PBS緩沖液按10-1～10-8進行梯度稀釋，每個梯度稀釋液吸取50 μL在瓊脂MW培養(yǎng)基進行涂板。瓊脂MW培養(yǎng)基配方參照Davis 等[9]，培養(yǎng)基pH6.8～7.0。配制培養(yǎng)基的所有試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。28℃培養(yǎng)6～8 d后，挑取單菌落進行純化培養(yǎng)。收集純培養(yǎng)的菌體，用蒸餾水配制成1×108 cfu/mL接種懸浮液，對溫室種植的甘蔗進行人工接種，接種方法參照Rott等[10]的方法。以無菌水處理作對照，觀察病害發(fā)生發(fā)展情況，并對接種后發(fā)病的植株進行病原菌再分離。

1.3菌株DNA提取

將純化培養(yǎng)的菌株分別轉(zhuǎn)接至2 mL MW液體培養(yǎng)基中，于28℃、200 r/min條件下培養(yǎng)7 d，12 000 r/min離心收集菌體，棄上清，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取DNA。DNA提取步驟參照試劑盒說明書。

1.4多位點基因序列擴增

擴增X. albilineans的16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因的引物參考文獻(xiàn)[11]，引物序列見表1。25 μL擴增反應(yīng)體系包括ddH2O 10.5 μL、2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL、DNA 模板1.0 μL、上、下游引物各0.5 μL （20 μg/μL）。PCR擴增程序為： 95℃預(yù)變性5 min; 94℃變性1 min，55℃退火1 min， 72℃延伸1 min， 25個循環(huán); 72℃延伸10 min。取10 μL擴增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

1.5PCR產(chǎn)物克隆、測序及序列分析

使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）回收PCR產(chǎn)物目的片段，并將其與pEASYT5（北京全式金生物技術(shù)有限公司）進行連接轉(zhuǎn)化，每個轉(zhuǎn)化挑選6個陽性克隆送華大基因測序。測序結(jié)果使用BLAST進行對比。使用DNAMAN V 6.0進行序列一致性分析。運用MEGA V 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[12]，采用neighborjoining法建樹，模式選擇Kimura 2parameter，自舉檢測（bootstrap）重復(fù)1 000 次。

2結(jié)果與分析

2.1田間癥狀觀察

2017年在云南保山、孟定和金平蔗區(qū)的甘蔗上觀察到疑似白條病的病害。病害癥狀主要表現(xiàn)為葉片上產(chǎn)生白色條紋，沿維管束伸展，有的葉片大面積白化。染病較重的病株蔗莖節(jié)間變短，葉片短直，莖的節(jié)部長出許多側(cè)芽和細(xì)小的分蘗，分蘗的葉片上也出現(xiàn)上述的白色條紋 （圖1a）。

2.2柯赫氏法則驗證

從保山、孟定和金平采集的蔗莖樣品中均分離得到圓形，凸面，光滑，有光澤，黃色的細(xì)菌菌落 （圖1b）。對分離到的菌株進行回接驗證，接種20 d后，接種甘蔗植株的葉片上出現(xiàn)了白色條紋，新發(fā)出的葉片葉尖白化，癥狀與田間發(fā)病癥狀相似 （圖1c）。對照甘蔗沒有觀察到任何癥狀。從接種發(fā)病的蔗莖中重新分離得到了相同的黃色菌落。經(jīng)柯赫氏法則驗證，從蔗莖中分離得到的該細(xì)菌為甘蔗白條病的病原菌。

2.3病原菌的多基因聯(lián)合鑒定

本研究測定了獲得的所有菌株的16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因的部分序列（表2）。結(jié)果表明，來自云南孟定、保山和金平的18個菌株的這3個基因的核苷酸序列一致性均為100%，與X. albilineans菌株GPE PC73菌株 （GenBank登錄號： FP565176） 的3個基因的核苷酸序列一致性也均為100%。分別使用這3個基因序列與黃單胞菌屬的其他種構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹 （圖2～4）。在基于16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因構(gòu)建的3個系統(tǒng)發(fā)育樹中，本研究所獲得的菌株與X. albilineans菌株均處于同一分支，明顯區(qū)分于黃單胞菌屬的其他種，表明本研究獲得的病原菌與X. albilineans親緣關(guān)系最近。

3結(jié)論與討論

甘蔗白條病是由X. albilineans引起的甘蔗重要病害。本研究通過對采自云南保山、孟定和金平蔗區(qū)的疑似白條病病株進行病原菌分離純化，柯赫氏法則驗證，并結(jié)合16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因部分序列對分離得到的菌株進行了分子鑒定，最終確定云南保山、孟定和金平蔗區(qū)發(fā)生的病害為X.albilineans引起的甘蔗白條病。本研究可為中國今后開展甘蔗白條病的深入研究和科學(xué)有效防控奠定基礎(chǔ)和提供參考依據(jù)。

甘蔗白條病是一種易隨種苗傳播的危險性病害，對甘蔗生產(chǎn)和發(fā)展有潛在的威脅。本研究采集的樣品均來自各蔗區(qū)的甘蔗新品種和良種繁育基地，因此，有必要加強對良繁基地擴繁種苗和引進及外調(diào)甘蔗的白條黃單胞菌的檢疫和監(jiān)測，從源頭上控制白條黃單胞菌擴散蔓延，確保甘蔗安全生產(chǎn)和蔗糖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。另外，今后在加強白條病檢疫和監(jiān)測的同時，應(yīng)加強甘蔗白條病優(yōu)良抗源材料和抗病品種的評價篩選，為選育和利用抗病品種有效防控甘蔗白條病提供優(yōu)良抗源材料。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）