小麥矮腥黑粉菌侵染小麥子房的激光共聚焦顯微觀察方法

李超 陳德來

摘要本試驗利用碘化丙啶（propidium iodide）和Alexa Flour 488（AF 488）標(biāo)記的麥胚凝集素（WGA）分別對小麥子房細(xì)胞和小麥矮腥黑粉菌進(jìn)行染色，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡成像系統(tǒng)獲取小麥子房的三維立體圖像。該技術(shù)可獲得清晰的小麥子房細(xì)胞圖像，并觀察小麥矮腥黑粉菌在小麥子房中的侵染狀況。該方法將為研究病原菌在寄主體內(nèi)的分布提供可參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞小麥矮腥黑粉菌;碘化丙啶;麥胚凝集素;激光共聚焦顯微鏡

中圖分類號：S 435.121

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018059

小麥矮腥黑粉菌Tilletia controversa Kühn（TCK）引起的小麥矮腥黑穗病對小麥的安全生產(chǎn)危害巨大[1]。被小麥矮腥黑粉菌侵染發(fā)病的小麥植株多分蘗和矮化，正常的籽粒被發(fā)育成熟的孢子團（菌癭）完全取代形成病粒，通常發(fā)病率約等于產(chǎn)量損失率[12]。除了導(dǎo)致小麥產(chǎn)量損失外，小麥矮腥黑粉菌冬孢子中含有的三甲胺會嚴(yán)重影響小麥面粉的品質(zhì)和人體健康，而且該病菌在2007年被列入《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》[3]。我國的部分冬麥區(qū)也面臨小麥矮腥黑粉菌傳入和定殖的風(fēng)險[46]。當(dāng)前大多數(shù)研究都集中在對小麥矮腥黑粉菌的風(fēng)險分析和分子鑒定[79]上，并取得了長足的進(jìn)展和廣泛的應(yīng)用，使得小麥矮腥黑粉菌的檢測靈敏度可以達(dá)到0.1 fg/μL[1011]。然而，小麥矮腥黑粉菌與寄主互作方面的研究卻極少見，該方面的研究將加深我們對小麥矮腥黑粉菌侵染機制的理解，并為小麥矮腥黑穗病的有效防治提供理論依據(jù)。

病原菌在寄主體內(nèi)的顯微觀察是了解病原菌侵染過程較為直觀的方式。傳統(tǒng)的觀察方法是將寄主組織整體透明染色后借助顯微鏡觀察，操作步驟十分耗時和繁瑣，制片過程中還有可能破壞幼嫩的植物組織[12]。而利用綠色熒光蛋白標(biāo)記病原菌再借助熒光顯微鏡觀察的方法是過去十幾年發(fā)展比較成熟的另一種技術(shù)[1315]，在許多病原菌的侵染觀察上獲得應(yīng)用[1618]。但綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)化對于某些真菌難度很大，被標(biāo)記病原菌的熒光表達(dá)量差異也制約著該方法的準(zhǔn)確性[19]。當(dāng)前，借助某些熒光染料對菌絲染色并在熒光顯微鏡下觀察菌絲的方法取得了顯著的效果，如Solophenyl Flavine 7GFE[12，20]和苯胺藍(lán)[21]等，這種利用熒光染料與菌絲細(xì)胞質(zhì)成分特異性結(jié)合的方法在操作上十分便捷，熒光成像質(zhì)量高，有著廣泛的前景。然而，小麥矮腥黑粉菌侵染小麥子房的細(xì)胞學(xué)研究一直以來都停留在組織切片技術(shù)上[2，22]。因此，有必要開發(fā)一種更直觀便捷的方法來觀察小麥矮腥黑粉菌對寄主的侵染狀況。本文借鑒當(dāng)前菌絲染色的方法結(jié)合寄主組織染色，在激光共聚焦顯微鏡下可實現(xiàn)方便、快捷、準(zhǔn)確地觀察小麥矮腥黑粉菌侵染小麥子房的顯微過程。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1供試樣品

本試驗所需的小麥矮腥黑穗病發(fā)病樣品是參照姚卓等[23]的人工培養(yǎng)和室內(nèi)接種方法，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所國家生物安全中心中高危病原菌實驗室的超低溫植物培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)獲得。接種用的供試菌株由美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究院（United States Department of Agriculture， Agricultural Research Service）提供。

1.1.2主要試劑和儀器

本試驗所需的主要試劑：無水乙醇、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline， PBS， pH=7.4）和吐溫20（Tween 20）購自北京廣達(dá)恒益生物科技有限公司，碘化丙啶（propidium iodide， PI）和Alexa Flour 488（AF 488）標(biāo)記的麥胚凝集素（wheat germ agglutinin， WGA）由北京冰達(dá)生物科技有限公司代購。

主要儀器：鑷子（DUMONT 41005AntimagneticE， China）、體視顯微鏡（Laica S6D， Germany）、全自動倒置熒光顯微鏡（Olympus IX83， Japan）、激光共聚焦顯微鏡（Leica SP8， Germany）。

1.2方法

1.2.1采樣

在小麥生長到孕穗期后開始采樣，每隔24 h進(jìn)行采樣，每次采樣只采集小穗上的一粒并迅速置于無水乙醇中保存。

1.2.2子房和胚珠的分離

采集的小穗在體視顯微鏡下進(jìn)行觀察并使用鑷子解剖。剝掉外稃、內(nèi)稃和花藥，將子房從小穗軸上剝離并將離體子房浸入無水乙醇中保存。利用鑷子破壞膨大子房的子房壁組織獲得離體胚珠。全自動倒置熒光顯微成像系統(tǒng)測量離體子房和胚珠的直徑大小。

1.2.3染色

離體子房和胚珠先后置于10 μg/mL PI和0.1%吐溫20分別染色60 min，再置于20 μg/mL WGAAF 488中染色60 min;染色完成后使用10×PBS沖洗4～6次，每次沖洗時間不少于2 min。將完成染色處理的離體子房和胚珠保存在10×PBS溶液中準(zhǔn)備觀察。所有染色過程均在室溫下進(jìn)行。

1.2.4樣品的觀察

將染色處理后的離體子房和胚珠放置玻片上，并倒置于激光共聚焦顯微鏡成像系統(tǒng)的載物臺上，進(jìn)行觀察并層掃拍照。激光發(fā)射光波的設(shè)定參數(shù)為WGAAF 488激發(fā)藍(lán)光波長488 nm，發(fā)射光波長為510～570 nm;PI激發(fā)綠光波長561 nm，發(fā)射光波長為590～820 nm。

2結(jié)果和分析

在染色過程中，WGA作為從谷物中分離的植物源凝集素蛋白，可特異性地與真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)結(jié)合并誘導(dǎo)寄主和病原菌之間的特異性識別[24]。Alexa Flour 488偶聯(lián)蛋白優(yōu)于包括Cy2在內(nèi)的其他熒光素，不僅亮度更高，而且光穩(wěn)定性更好，在pH為4～10的范圍內(nèi)均可以保持穩(wěn)定狀態(tài)。Alexa Flour 488與WGA共軛結(jié)合所制成的染料可以使小麥矮腥黑粉菌菌絲在激光共聚焦顯微鏡的特定光波下呈現(xiàn)綠色。PI是一種常見的熒光染料，可以與寄主細(xì)胞內(nèi)的核酸結(jié)合使細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡的特定光波下呈現(xiàn)紅色。小麥矮腥黑穗病發(fā)病樣品的整個培養(yǎng)過程都處于無菌和消毒的環(huán)境中，所有的用具都經(jīng)過滅菌，確保只接種小麥矮腥黑粉菌。因此，綜合利用WGAAF 488和PI染色可以在激光共聚焦顯微鏡下顯示小麥矮腥黑粉菌菌絲在小麥子房或胚珠中的侵染狀態(tài)和分布區(qū)域（圖1）。

3討論

本試驗為研究病原菌侵染植物組織提供了一種三維立體構(gòu)象技術(shù)，采用本試驗所述的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)對小麥矮腥黑粉菌侵染小麥子房和胚珠的過程進(jìn)行追蹤和觀察。結(jié)果顯示，這種方法能夠?qū)﹄x體子房和胚珠內(nèi)部細(xì)胞的結(jié)構(gòu)進(jìn)行準(zhǔn)確成像，并識別小麥矮腥黑粉菌的菌絲。

當(dāng)前，激光共聚焦顯微鏡被廣泛應(yīng)用于分子細(xì)胞生物學(xué)的研究，并在病原菌亞細(xì)胞定位、組織細(xì)胞生理代謝觀察和侵染循環(huán)研究等方面發(fā)揮著重要作用，相比于其他顯微鏡技術(shù)，CLSM大大提高了熒光圖像的分辨率和準(zhǔn)確率[2526]。利用激光共聚焦顯微鏡追蹤和觀察植物體內(nèi)的病原菌已有先例，Kelliher等[27]利用激光共聚焦顯微鏡揭示了玉米花藥中5種細(xì)胞的發(fā)育歷程和分裂模式;Gao等[28]在此基礎(chǔ)上利用激光共聚焦顯微鏡并結(jié)合數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)玉米瘤黑粉菌Ustilago maydis能夠影響并延遲玉米花藥細(xì)胞的發(fā)育;蔚慧欣等[29]也利用WGAAF 488和PI染色，觀察了小麥矮腥黑粉菌在小麥葉片中的初步侵染。在激光共聚焦顯微鏡的操作上，我們適當(dāng)提高了發(fā)射光波的長度范圍以更好地識別染料的熒光。在我們的研究中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)離體子房直徑比較大的時候，激光共聚焦顯微鏡對子房內(nèi)部結(jié)構(gòu)尤其是胚珠的成像相較于外部子房壁細(xì)胞是比較模糊的，因此我們對子房進(jìn)一步解剖并分離出胚珠，獲得了胚珠細(xì)胞的清晰圖像（圖1d～f）。

與傳統(tǒng)的植物石蠟切片技術(shù)相比，本試驗的方法避免了制片過程中對子房和胚珠內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，尤其是對組織細(xì)胞的變形和損傷。傳統(tǒng)技術(shù)方法所呈現(xiàn)的二維平面圖像無法對整個小麥子房和胚珠的立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描，而本試驗的方法在精準(zhǔn)獲取植物組織細(xì)胞圖像的基礎(chǔ)上，還能夠?qū)Σ≡M(jìn)行標(biāo)記和示蹤。從結(jié)果上來看，本試驗的方法為研究病原菌侵染寄主組織提供了一種有意義的解決方案。

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（責(zé)任編輯：田喆）