重大檢疫性害蟲玉米根螢葉甲的種特異性SSCOⅠ快速檢測(cè)技術(shù)研究

張桂芬 王玉生 郭建洋 冼曉青

摘要玉米根螢葉甲在歐洲和美國是一種嚴(yán)重為害玉米的入侵性害蟲，傳播速度快，侵入我國的可能性極高。本文針對(duì)其難以快速準(zhǔn)確進(jìn)行形態(tài)鑒別的問題，以玉米根螢葉甲為研究對(duì)象，以其他9種/生物型葉甲總科常見害蟲為參照，采用基于COⅠ基因的種特異性PCR方法（speciesspecific COⅠ， SSCOⅠ），研究其快速分子檢測(cè)鑒定技術(shù)。通過提取10種/生物型葉甲DNA和通用型引物擴(kuò)增測(cè)序，獲得其基因片段的堿基序列，并比對(duì)分析設(shè)計(jì)1對(duì)玉米根螢葉甲特異性引物（DvvZCE1/DvvZCF1），其擴(kuò)增片段為462 bp。種特異性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，該對(duì)引物只對(duì)玉米根螢葉甲的COⅠ基因具有擴(kuò)增能力，對(duì)其他常見葉甲類害蟲，包括玉米雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲、榆黃毛螢葉甲、黃曲條跳甲、油菜蚤跳甲、黃點(diǎn)直緣跳甲、蓮草直胸跳甲、枸杞負(fù)泥蟲以及褐足角胸葉甲的棕黃型和藍(lán)綠型沒有擴(kuò)增能力，該對(duì)引物不僅對(duì)成蟲有很好的擴(kuò)增效果，對(duì)單粒卵、2齡幼蟲以及成蟲殘?bào)w（包括觸角、頭部、胸部、腹部、前足、后足）也具有同樣的擴(kuò)增效果，其最低檢出閾值為102.73 pg/μL（相當(dāng)于1/122 880頭雌性成蟲）。玉米根螢葉甲特異性SSCOⅠ檢測(cè)技術(shù)在其口岸檢疫，以及有效阻截中具有重要意義。

關(guān)鍵詞玉米根螢葉甲;SSCOⅠ標(biāo)記;種特異性引物;快速鑒定;分子檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S 435.132

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018031

玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera LeConte，又名玉米切根葉甲，屬于鞘翅目，葉甲總科，葉甲科，螢葉甲亞科，根螢葉甲屬;原產(chǎn)于北美洲的南部和中美洲的北部，是為害玉米的一種世界性毀滅性檢疫害蟲[12]，2007年農(nóng)業(yè)部將根螢葉甲屬列入《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》[3]。玉米根螢葉甲的成蟲和幼蟲均可造成為害，且幼蟲較成蟲為害更為嚴(yán)重;寄主植物包括禾本科、菊科、豆科及葫蘆科等，而玉米受害最為嚴(yán)重[4]。其中，成蟲主要以玉米植株的雌穗花絲，雄穗花穗、花粉，葉片以及玉米的幼嫩籽粒等為食，亦可取食其他植物的花粉和葉片;為害葉片時(shí)成蟲主要取食葉片的上表皮，形成玻璃窗樣不規(guī)則的半透明條形斑;授粉期為害雌穗花絲使花穗呈齊頭剪斷狀，影響玉米的授粉和受精，導(dǎo)致結(jié)實(shí)不良[56]。幼蟲主要以玉米的須根和主根或其他寄主植物如小麥、大豆、南瓜、向日葵等的根為食[4， 79];初孵幼蟲取食須根，大齡幼蟲鉆入根部組織內(nèi)蛀食為害，不僅影響水分和養(yǎng)分的輸送，形成癟粒造成減產(chǎn)，甚或使植株干枯死亡;此外，幼蟲鉆蛀所形成的傷口還可誘發(fā)病菌侵染，導(dǎo)致植株根部腐爛，引發(fā)植株倒伏，甚至死亡[56， 1011]。倘若防治不及時(shí)，可造成玉米減產(chǎn)10%～40%，甚至高達(dá)90%的產(chǎn)量損失[1213]。如在歐洲，據(jù)測(cè)算玉米根螢葉甲每年可造成大約4.72億歐元的損失[14];在美國，則每年可造成大約8億美元的玉米產(chǎn)量損失和2億美元的防治費(fèi)用，并因此被冠以“十億美元害蟲”的名號(hào)[5]。此外，玉米根螢葉甲還可以傳播玉米褪綠斑駁病毒（MCMV），使玉米病毒病流行[15]，造成絕產(chǎn)絕收。

1955年之前，玉米根螢葉甲主要在美國的中西部地區(qū)發(fā)生與為害，是該地區(qū)玉米的一種重要害蟲[5]。然而，在此后的50年間卻以每年44～125 km的速度迅速向東擴(kuò)張，1985-2005年擴(kuò)散至大西洋沿岸并在北美和中美地區(qū)廣泛分布，發(fā)生區(qū)域主要包括加拿大、美國、墨西哥、哥斯達(dá)黎加、危地馬拉和尼加拉瓜等國家[16]。1992年，玉米根螢葉甲首次在位于歐洲東南部的塞爾維亞（前南斯拉夫）首都貝爾格萊德國際機(jī)場(chǎng)附近的玉米田被發(fā)現(xiàn)[17]，之后在歐洲迅速擴(kuò)散蔓延[1819]，目前已在阿爾巴尼亞、奧地利、白俄羅斯、比利時(shí)、波黑（波斯尼亞黑塞哥維那）、保加利亞、克羅地亞、捷克共和國、法國、德國、希臘、匈牙利、意大利、黑山共和國、荷蘭（已根除）、波蘭、羅馬尼亞、俄羅斯聯(lián)邦、塞爾維亞（前南斯拉夫）、斯洛伐克、斯洛文尼亞、瑞士、烏克蘭、英國等24個(gè)國家發(fā)生與為害，使玉米產(chǎn)業(yè)遭受了嚴(yán)重打擊[9， 1819];已經(jīng)成為歐美乃至世界玉米產(chǎn)業(yè)的一種毀滅性害蟲[1819]。盡管目前我國尚未有玉米根螢葉甲的發(fā)生，然而由于我國每年從疫情發(fā)生國如美國、匈牙利等大量進(jìn)口玉米（海關(guān)信息網(wǎng) http：∥www.haiguan.info/），其侵入我國的可能性極大[20];進(jìn)一步的定性與定量風(fēng)險(xiǎn)分析表明，該種根螢葉甲屬于高度危險(xiǎn)性有害生物（綜合風(fēng)險(xiǎn)值為2.08）[21]，并且我國玉米的主要種植區(qū)域（如東北平原和華北平原）與其適生區(qū)域高度吻合[22]。因此加強(qiáng)對(duì)玉米根螢葉甲的檢疫檢驗(yàn)和檢測(cè)監(jiān)測(cè)，是保障我國玉米，以及小麥、向日葵等產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的首要前提。

以往，葉甲類害蟲的識(shí)別與鑒定主要是依據(jù)成蟲的外部形態(tài)特征。玉米根螢葉甲為小型甲蟲類昆蟲，成蟲體長(zhǎng)約4.4～6.8 mm，與其他近緣種葉甲的形態(tài)極為相似[23]，未經(jīng)專業(yè)訓(xùn)練的普通植保植檢人員很難對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別;至于它的卵（長(zhǎng)0.65 mm、寬0.45 mm，初產(chǎn)為白色，近孵化時(shí)為淡黃色）、幼蟲（初孵半透明，幾近無色或白色）和蛹[1， 23]，即使是經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)亦難以將其與近緣種快速區(qū)分開來。故而，本研究擬以線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（mitochondrial DNA cytochrome c oxidase submit I， mtDNA COⅠ）基因?yàn)榘袠?biāo)，研究建立靶定玉米根螢葉甲的種特異性（speciesspecific COⅠ， SSCOⅠ） PCR檢測(cè)技術(shù)體系，以期為玉米根螢葉甲快速檢測(cè)鑒定，有效防范其侵入我國提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1供試蟲源

玉米根螢葉甲分別來自匈牙利和美國，寄主植物均為玉米;本文涉及的其他葉甲總科昆蟲共計(jì)9種，相關(guān)具體信息詳見表1。

1.2DNA提取

以玉米根螢葉甲以及其他9種/生物型葉甲（包括雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲、榆黃毛螢葉甲、黃曲條跳甲、油菜蚤跳甲、黃點(diǎn)直緣跳甲、蓮草直胸跳甲，枸杞負(fù)泥蟲、褐足角胸葉甲（棕黃型）和褐足角胸葉甲（藍(lán)綠型））為對(duì)象，以鹽漬法[24]略加改進(jìn)，提取單頭葉甲總DNA。將單頭葉甲成蟲的部分組織（其中，黃曲條跳甲和油菜蚤跳甲為單頭整個(gè)蟲體，其余種類均為腹部1/4）置于1.5 mL的離心管中，加入液氮后以玻璃研磨棒充分研磨，然后以150 μL緩沖液（50 mmol/L TrisHCl， 1 mmol/L EDTA， 1% SDS， 20 mmol/L NaCl; pH 8.0）分2次清洗研磨棒，混勻，加入5 μL蛋白酶K（20 mg/mL），充分混勻后于60℃水浴1 h（中途混勻1次）;然后沸水浴8 min，加入220 μL 氯仿/異戊醇（V∶V=24∶1）抽提液，輕柔混勻數(shù)十次后，冰上放置30 min;4℃、14 000 r/min 離心10 min，取上清液約350 μL移入另一離心管，加入800 μL預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，待出現(xiàn)少量絮狀沉淀后于-20℃放置30 min;4℃、14 000 r/min離心10 min，小心棄去上清液。加入300 μL預(yù)冷的75%乙醇洗滌，4℃、14 000 r/min離心10 min，小心棄去上清液;然后將離心管倒扣于潔凈濾紙上，自然干燥30 min后每管加入30 μL超純水，充分溶解，以超微量分光光度計(jì)（NanoPhotometerTM P330， Implen， Munich， Germany）測(cè)定提取的DNA濃度，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3葉甲類昆蟲COⅠ基因序列的PCR擴(kuò)增

以玉米根螢葉甲以及其他9種/生物型常見葉甲總科害蟲的DNA為模板，以mtDNA COⅠ基因的通用型引物對(duì)LCO1490/HCO2198（上游引物和下游引物的堿基序列分別為L(zhǎng)CO1490：5′GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G3′和HCO2198： 5′TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度約為680 bp[25]。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中，10× Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL，上游引物和下游引物（5 pmol/L）各為0.5 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）0.3 μL，模板DNA 2.0 μL，以18.7 μL超純水補(bǔ)齊。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s， 51℃ 30 s， 72℃ 50 s，35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在基因擴(kuò)增儀（ABI9700）上運(yùn)行。取5 μL PCR產(chǎn)物在含有GoldView的1.0%（W∶V）瓊脂糖凝膠上以90 V電泳（BioRad PowerPac Basic）分離45 min后，以GelDocUniversal HoodII型凝膠成像系統(tǒng)（BIORAD Laboratories）檢測(cè)電泳結(jié)果。經(jīng)電泳檢測(cè)驗(yàn)證合格的PCR產(chǎn)物，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。依據(jù)標(biāo)本采集情況，分別檢測(cè)3～8頭。

1.4玉米根螢葉甲SSPCR引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)本研究中測(cè)序獲得的玉米根螢葉甲和其他9種/生物型葉甲以及數(shù)據(jù)庫中已公開的玉米根螢葉甲的堿基序列，以軟件MEGA6、Oligo7進(jìn)行比對(duì)分析，設(shè)計(jì)玉米根螢葉甲特異性SSCOⅠ引物1對(duì)（DvvZCE1/DvvZCF1），上游引物DvvZCE1的堿基序列為5′ GTA CGA GCA GAA TTA GGA AGG3′，下游引物DvvZCF1的堿基序列為5′ AAT TAC GAC AGC TCA AAC AAA TAG G 3′（生工生物工程（上海）股份有限公司協(xié)助合成），可擴(kuò)增出462 bp的片段。

1.5SSCOⅠ引物的種特異性和靈敏性檢驗(yàn)

分別以田間常見9種/生物型葉甲的成蟲mtDNA為模板，以玉米根螢葉甲為陽性對(duì)照，檢驗(yàn)玉米根螢葉甲SSCOⅠ引物 DvvZCE1/DvvZCF1的種特異性。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中10× Buffer 2.5 μL（含Mg2+），dNTPs 0.5 μL（0.2 mmol/L），上游引物和下游引物各0.5 μL（5 pmol/L），Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，模板DNA 2 μL，超純水18.7 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 40 s，35個(gè)循環(huán);最后72℃ 延伸7 min。每種葉甲分別檢測(cè)8頭成蟲。同時(shí)，以卵（單粒）、2齡幼蟲（腹部1/3）以及成蟲殘?bào)w[包括觸角（1對(duì)）、頭部、胸部（1/2）、腹部（1/4）、前足（1對(duì)）、后足（1對(duì)）] DNA為模板，進(jìn)行靈敏性檢驗(yàn);以梯度稀釋的單頭雌性成蟲（腹部1/4）DNA為模板，進(jìn)行最低檢測(cè)閾值測(cè)定，每種蟲態(tài)/成蟲殘?bào)w或濃度梯度分別檢測(cè)8頭。

2結(jié)果與分析

2.1葉甲類昆蟲COⅠ基因5′端序列擴(kuò)增及SSCOⅠ標(biāo)記分析

以玉米根螢葉甲以及其他9種/生物型葉甲即雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲、榆黃毛螢葉甲、黃曲條跳甲、油菜蚤跳甲、黃點(diǎn)直緣跳甲、蓮草直胸跳甲、枸杞負(fù)泥蟲、褐足角胸葉甲（棕黃型）和褐足角胸葉甲（藍(lán)綠型）成蟲的mtDNA為模板，以通用型引物L(fēng)CO1490/HCO2198進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，10種葉甲均能擴(kuò)增出一條清晰的目的片段（圖1）;對(duì)經(jīng)電泳檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，結(jié)果表明，該片段約680 bp，為線粒體DNA COⅠ基因5′端的克隆片段。根據(jù)10種葉甲的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)玉米根螢葉甲特異性SSCOⅠ引物1對(duì)（DvvZCE1/DvvZCF1），其擴(kuò)增片段的大小為462 bp。

2.2玉米根螢葉甲SSCOⅠ引物種特異性檢驗(yàn)

以玉米根螢葉甲和其他9種/生物型常見葉甲的成蟲DNA為模板，以上述所設(shè)計(jì)的特異性SSCOⅠ引物對(duì)DvvZCE1/DvvZCF1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，該引物只對(duì)玉米根螢葉甲具有擴(kuò)增效果，對(duì)其他9種近緣種/生物型葉甲不具有擴(kuò)增能力，表明該對(duì)引物為玉米根螢葉甲的特異性引物（圖2）。

2.3玉米根螢葉甲SSCOⅠ引物靈敏性檢驗(yàn)

以玉米根螢葉甲的卵、2齡幼蟲、雄性成蟲以及雌性成蟲及其殘?bào)wDNA為模板，以SSCOⅠ引物DvvZCE1/DvvZCF1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，不同蟲態(tài)、不同性別以及雌性成蟲的不同殘?bào)w均能穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出462 bp的特異性靶標(biāo)片段（圖3）。

2.4玉米根螢葉甲SSCOⅠ引物的檢測(cè)閾值

將玉米根螢葉甲雌性成蟲DNA模板以2倍遞減梯度進(jìn)行稀釋，檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)DNA濃度稀釋為102.73 pg/μL（相當(dāng)于1/122 880頭雌性成蟲）時(shí)，所有個(gè)體均可擴(kuò)增出462 bp的靶標(biāo)片段，而且條帶清晰明亮（圖4）。

3討論

玉米根螢葉甲是玉米的毀滅性害蟲，也是我國禁止進(jìn)境的植物檢疫性有害生物，極易隨進(jìn)口玉米（如青儲(chǔ)玉米）（海關(guān)信息網(wǎng) http：∥www.haiguan.info/）等的國際貿(mào)易活動(dòng)侵入我國[9]。玉米根螢葉甲主要以幼蟲取食玉米須根、蛀食玉米主根，使植株倒伏乃至死亡[56]，同時(shí)還可傳播玉米褪綠斑駁病毒，使病毒病大流行[15]，造成玉米絕產(chǎn)絕收，一旦傳入將嚴(yán)重影響我國玉米產(chǎn)業(yè)以及小麥等其他禾本科糧食作物的健康發(fā)展，嚴(yán)重威脅我國糧食安全和生態(tài)安全。

玉米根螢葉甲可以藏匿在植物生長(zhǎng)介質(zhì)中的卵，鉆蛀在根或根莖中的幼蟲，以及隱藏在嫩芽、葉片、莖稈、花序中的成蟲等，借助貿(mào)易活動(dòng)進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播[9]。目前，玉米根螢葉甲尚未入侵我國，但該種葉甲已在20多個(gè)國家包括我國的鄰邦俄羅斯發(fā)生，并且進(jìn)一步傳播擴(kuò)散趨勢(shì)明顯，其潛在適生區(qū)與我國玉米的主要種植區(qū)極度吻合[22]，因此研發(fā)快速準(zhǔn)確的檢測(cè)鑒定技術(shù)是防止玉米根螢葉甲入侵我國，保障我國糧食安全和生態(tài)安全的緊要前提，而以往基于外部形態(tài)特征的比較形態(tài)學(xué)鑒定法不能滿足快速通關(guān)和有效阻截的基本需求。本研究研發(fā)的玉米根螢葉甲特異性SSCOⅠ檢測(cè)技術(shù)專一性強(qiáng)，只對(duì)玉米根螢葉甲具有擴(kuò)增作用，對(duì)其他常見的近緣種葉甲沒有擴(kuò)增效果。而且，該檢測(cè)技術(shù)的靈敏度高，不僅可以檢測(cè)玉米根螢葉甲的單粒卵，還可檢測(cè)成蟲的殘?bào)w，包括頭部、胸部、腹部以及觸角、前足、后足等;以成蟲DNA為模板進(jìn)行梯度稀釋，其最低檢測(cè)閾值為102.73 pg/μL，相當(dāng)于1/122 880頭雌性成蟲。將特異性引物DvvZCE1/DvvZCF1擴(kuò)增片段的測(cè)序結(jié)果與GenBank進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，該片段與玉米根螢葉甲的同源性為99%～100%，而與其他種類昆蟲的同源性為87%～90%，包括同屬近緣種十一星根螢葉甲Diabrotica undecimpunctata （L.）（同源性88%）和巴氏根螢葉甲Diabrotica barberi Smith & Lawrence（同源性90%）（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#743172760）。顯示該檢測(cè)技術(shù)完全可以用于口岸進(jìn)境植物檢疫中玉米根螢葉甲的檢測(cè)。

目前，基于分子生物學(xué)的葉甲類昆蟲識(shí)別鑒定技術(shù)研究時(shí)有報(bào)道，如RFLP（restriction fragment length polymorphism）技術(shù)[2627]、基于mtDNA COⅠ單基因[28]和mtDNA COⅠ/rDNA ITS2聯(lián)合基因[29]的條形碼技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)[30]等。然而，這些技術(shù)各具優(yōu)缺點(diǎn)，比如RFLP技術(shù)操作較為繁瑣且需要酶切，對(duì)DNA的需求量也比較大;DNA條形碼技術(shù)需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化、序列測(cè)定及比對(duì)分析;實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)所需要的儀器設(shè)備較為昂貴、應(yīng)用受限。種特異性SSCOⅠ技術(shù)由基于多拷貝的mtDNA COⅠ基因標(biāo)記技術(shù)發(fā)展而來，具有特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高，與實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的檢測(cè)靈敏度相當(dāng)[30]，以及譜帶單一、結(jié)果直觀、重復(fù)性能好等諸多優(yōu)點(diǎn)，完全可以用于大規(guī)模快速檢測(cè)分析[31]。

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（責(zé)任編輯：田喆）