NADPH氧化酶抑制劑Apocynin預(yù)防脂多糖心肌纖維化的研究

黃禮兵，鄒 蓉，朱明慧，周玉弟，鄭 曼

NADPH氧化酶抑制劑Apocynin預(yù)防脂多糖心肌纖維化的研究

黃禮兵，鄒 蓉，朱明慧，周玉弟，鄭 曼

目的探討NADPH氧化酶抑制劑Apocynin對(duì)脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)心肌纖維化的預(yù)防作用。方法40只小鼠隨機(jī)分成4組：對(duì)照組(CON)、Apocynin組、LPS組和LPS+Apocynin組，每組10只。LPS組和LPS+Apocynin組給予LPS 10 mg/kg，每周1次，連續(xù)4周；Apocynin組和LPS+Apocynin組給予Apocynin 10 mg/kg，1次/d，連續(xù)4周。采用天狼星紅染色評(píng)估心肌纖維化程度，RT-PCR檢測(cè)ColⅠa1、ColⅢa1、MMP2、MMP9 mRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)心肌gp91phox和p67phox的表達(dá)，DHE檢測(cè)心肌活性氧生成。結(jié)果小鼠LPS注射4周后出現(xiàn)心肌纖維化。與對(duì)照組比較，LPS組心肌間質(zhì)內(nèi)彌漫性纖維組織顯著增多，膠原容積分?jǐn)?shù)增加，心肌組織中膠原相關(guān)因子ColⅠa1、ColⅢa1、MMP2、MMP9 mRNA表達(dá)明顯增加，心肌gp91phox和p67phox的表達(dá)增加，ROS生成增加(P<0.05)。與LPS組比較，Apocynin干預(yù)可抑制上述指標(biāo)的增加(P<0.05)。結(jié)論Apocynin能預(yù)防LPS誘導(dǎo)小鼠心肌纖維化，其效應(yīng)可能與抑制心肌gp91phox和p67phox過(guò)表達(dá)有關(guān)。

脂多糖；夾竹桃麻素；NADPH 氧化酶；纖維化

0 引言

心肌纖維化(Myocardial fibrosis，MF)是冠心病、高血壓病、肥厚性心肌病等多種心臟疾病發(fā)展到特定階段的共同病理改變，是心肌重塑的重要表現(xiàn)之一。高脂膳食、吸煙、消耗性疾病、2 型糖尿病等疾病會(huì)產(chǎn)生代謝性的內(nèi)毒素血癥[1]。循環(huán)中低劑量的LPS慢性刺激可以刺激心肌膠原纖維過(guò)量積聚，引起心肌纖維化，這種纖維化與腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活關(guān)系不大[2]。最新的研究表明，小鼠經(jīng)LPS 反復(fù)刺激后，心肌TGF-β和CTGF 并沒(méi)有發(fā)生明顯改變，而NADPH氧化酶2 (Nox2)可能參與了LPS刺激心肌成纖維細(xì)胞膠原合成[2]。Apocynin又稱加拿大麻素或夾竹桃麻素，本研究擬用NADPH 氧化酶抑制劑Apocynin (Apo)干預(yù)小鼠，觀察其對(duì)心肌組織纖維化和相關(guān)因子表達(dá)的影響，并探討可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型及干預(yù)方案 C57BL/6雄性小鼠40只，體重25～30 g，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：201511179。LPS、Apocynin購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich 公司。LPS誘導(dǎo)小鼠內(nèi)毒素心肌纖維化模型，按10 mg/kg腹腔注射，每周1次，共4周。將40只C57BL/6小鼠平均分為4組：①CON組：腹腔注射同模型組等體積鹽水(0.5 mL)；②Apocynin對(duì)照組：腹腔注射Apocynin 10 mg/kg，連續(xù)4周；③模型組(LPS組)：每周腹腔注射LPS 10 mg/kg(稀釋至0.5 mL) 1次，連續(xù)4周；④LPS+Apocynin組：LPS處理前0.5 h腹腔注射Apocynin 10 mg/kg，連續(xù)4周，LPS給藥同LPS組。

1.2 天狼星紅膠原染色 左心室心肌組織先于4%多聚甲醛中固定 24 h，充分水洗取出多聚甲醛后，脫水至蠟，石蠟包埋，將左心室心肌組織切成4 μm薄片，置于經(jīng)多聚賴氨酸處理的防脫載玻片上，烤片后備用。石蠟切片按照苦味酸-天狼星紅膠原染色法染色，采用尼康顯微鏡照相系統(tǒng)拍照，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析，測(cè)量心肌切片的膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF=心肌膠原面積/所測(cè)視野面積)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 釆用RT-PCR方法檢測(cè)心肌組織中ColⅠa1、ColⅢa1、MMP2、MMP9的mRNA水平。取組織30 mg使RNA充分溶解，提取RNA；取2 μL樣品，使用Nanodrop 2000測(cè)定RNA濃度和純度；按照Takara PrimeScript RT reagent kit說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4 Western blot檢測(cè) 考馬斯亮藍(lán)法總蛋白定量后，以等量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶于4 ℃冰箱中孵育封閉1 h。與一抗于室溫下溫孵2 h，無(wú)菌PBS漂洗4次后將膜與二抗反應(yīng)2 h。PVDF 膜用無(wú)菌PBS漂洗3次后，顯色、曝光、顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定光密度，進(jìn)行蛋白表達(dá)的定量分析。

1.5 活性氧檢測(cè) ROS(活性氧，Reactive oxygen species)熒光探針DHE能夠透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化，形成氧化乙啶，氧化乙啶摻入染色體DNA中，產(chǎn)生紅色熒光。用磷酸鹽緩沖鹽水工作液(PBS，pH 7.4)將DHE稀釋至10 μmol/L，取50 μL檢測(cè)液滴于組織上，37 ℃濕潤(rùn)環(huán)境中避光孵育30 min。孵育結(jié)束后，用PBS溶液洗2次，每次5 min。熒光顯微鏡下選擇 N21濾色鏡(激發(fā)波長(zhǎng)480～535 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590～610 nm)觀察和拍攝細(xì)胞紅色發(fā)射圖像，ROS 陽(yáng)性細(xì)胞在整個(gè)核區(qū)被染成紅色，隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野(400×)測(cè)定ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度單位。

2 結(jié)果

2.1 Apocynin對(duì)LPS心肌纖維化的預(yù)防作用 天狼星紅染色使心肌間質(zhì)內(nèi)膠原纖維呈紅色，其余心肌組織呈黃色。結(jié)果顯示，與正常組相比，LPS組心肌間質(zhì)內(nèi)彌漫性纖維組織輕度增多，心室的心肌間質(zhì)可見(jiàn)較多的紅色細(xì)纖維，血管周?chē)t色纖維組織較多，膠原面積分?jǐn)?shù)(10.8%)升高(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+Apo組膠原面積分?jǐn)?shù)(6.9%)降低(P<0.05)；Apocynin單獨(dú)給藥對(duì)纖維化無(wú)明顯作用(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 Apocynin預(yù)防LPS誘導(dǎo)心肌纖維化

2.2 Apocynin對(duì)LPS刺激小鼠心肌ColⅠa1、ColⅢa1、MMP2、MMP9 mRNA 表達(dá)水平的影響 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示，與CON組相比，LPS 刺激時(shí)，ColⅠa1、ColⅢa1、MMP2、MMP9 mRNA 表達(dá)水平均升高；而Apocynin處理可以顯著抑制上述因子水平(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 Apocynin對(duì)LPS刺激小鼠心肌組織Nox2、p67phox表達(dá)的影響 LPS刺激后，Nox2表達(dá)上調(diào)，小鼠心肌組織中Nox2、p67phox亞基的表達(dá)水平升高，而Apocynin可以下調(diào)Nox2、p67phox的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

表1 Apocynin對(duì)LPS刺激小鼠心肌纖維化相關(guān)因子表達(dá)的影響

注：與CON組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05

圖2 Apocynin對(duì)LPS刺激小鼠心肌組織Nox2及p67phox表達(dá)的影響

2.4 Apocynin對(duì)LPS刺激小鼠心肌組織ROS的抑制作用 NADPH氧化酶是體內(nèi)活性氧的主要來(lái)源。DHE 染色結(jié)果顯示，CON組小鼠心肌ROS生成量較少，熒光強(qiáng)度較弱。而LPS組ROS生成量明顯增加，紅色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)；與LPS組比較，LPS+Apo組ROS產(chǎn)生顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

3 討論

持續(xù)存在的慢性炎癥會(huì)使器官產(chǎn)生持續(xù)的應(yīng)激反應(yīng)，多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子釋放，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)紊亂和纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)升高的LPS 水平主要存在于2型糖尿病，呼吸系統(tǒng)、胃腸道和泌尿生殖道的慢性感染，代償心臟衰竭，代謝綜合征，肝硬化，酒精性脂肪肝疾病和肝炎等慢性疾病[1]。LPS可以引起單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞的免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)活性氧、活性氮、前列腺素和多種細(xì)胞因子的瀑布式產(chǎn)生與釋放，導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥。反復(fù)暴露于代謝性內(nèi)毒素血癥可誘導(dǎo)心肌纖維化，并且增加死亡率[1-2]。

圖3 Apocynin對(duì)LPS刺激小鼠心肌組織ROS的抑制作用

氧化應(yīng)激是許多器官纖維化的主要原因，在心臟中尤為突出。NADPH 氧化酶(Nox)可產(chǎn)生超氧陰離子(O2-)，能夠催化電子從NADPH 轉(zhuǎn)移至游離態(tài)的O2；Nox有7個(gè)成員，包括Nox1～Nox5、Duox1、Duox2。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，NADPH氧化酶的胞質(zhì)亞基p67phox向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移，并在其他小分子結(jié)合蛋白的參與下，與細(xì)胞膜亞基結(jié)合形成復(fù)合體而活化。Nox參與了多種病因引起的心臟纖維化。Johar等[3]發(fā)現(xiàn)，野生鼠接受AngⅡ或醛固酮后，纖連蛋白、原骨膠原Ⅰ和CTGF 合成增加，MMP-2和NF-κB活性增強(qiáng)，心肌纖維化明顯，而NADPH 氧化酶基因陰性(Nox2-/-)鼠不出現(xiàn)上述反應(yīng)。Nox4可以激活心肌Akt-mTOR和NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)心肌纖維化和重塑，而Nox2抑制劑則消除AngⅡ引起的心肌纖維化[4]。Apocynin是NADPH氧化酶抑制劑，可以預(yù)防LPS急性肺損傷[5]；LPS 刺激心肌可以引起心肌纖維化，伴隨著Nox2表達(dá)增加。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激會(huì)引起ColⅠa1、ColⅢa1及MMP2、MMP9 mRNA 表達(dá)水平升高，而后者可被Apocynin處理所抑制；此外，Apocynin處理可抑制NOX亞基Nox2與p67phox表達(dá)。

無(wú)論細(xì)胞靜息還是應(yīng)激狀態(tài)下，ROS介導(dǎo)的信號(hào)通路均發(fā)揮一系列功能[6]。LPS和ROS之間存在相互關(guān)系。LPS激活Nox，使巨噬細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS，引起急性肺損傷血管炎癥[7-9]。Nox2參與了LPS刺激后小鼠心功能不全，與下游的ERK1/2 及p38MAPK有關(guān)[10]。亞臨床劑量LPS 刺激產(chǎn)生ROS和氧化應(yīng)激。活性氧可以通過(guò)多種信號(hào)通路介導(dǎo)心肌細(xì)胞的肥大、凋亡，同時(shí)通過(guò)滅活NO等導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能的紊亂，進(jìn)而誘發(fā)或加重心肌纖維的發(fā)生[11]。本研究對(duì)小鼠心肌ROS進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)LPS刺激小鼠ROS增加明顯，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；而Apocynin可以抑制LPS引起的ROS增加，表明Apocynin通過(guò)減少ROS生成，抑制心肌纖維化。NADPH 氧化酶介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能是一個(gè)用于預(yù)防或治療脂多糖心肌纖維化的重要靶點(diǎn)[12]。

本研究存在一定的局限性。首先，Lew等[2]研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后，心肌NOX2表達(dá)上調(diào)，NOX4無(wú)明顯變化，而Apocynin是非特異性的NADPH氧化酶抑制劑，本研究結(jié)果不能肯定是哪種NOX參與LPS纖維化；其次，成纖維細(xì)胞在心肌纖維化中發(fā)揮重要作用，今后可采用心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)探討其中的具體機(jī)制。

總之，本研究提示，Apocynin可以預(yù)防LPS誘導(dǎo)心肌纖維化，為臨床預(yù)防和干預(yù)炎癥性心肌纖維化提供新的靶點(diǎn)和干預(yù)手段。

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NADPHoxidaseinhibitor-apocynininpreventingcardiacfibrosisinmiceexposedtosubclinicallipopolysaccharide

HUANG Li-bing,ZOU Rong,ZHU Ming-hui,ZHOU Yu-di,ZHENG Man

(Department of Anesthesiology,Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,China)

ObjectiveTo investigate the preventive effects of apocynin,an NADPH oxidase inhibitor,on cardiac fibrosis in mice exposed to subclinical lipopolysaccharide.MethodsTotally 40 male C57BL/6J mice were divided randomly into 4 groups:control group,apocynin group,LPS group and LPS+apocynin group.LPS was injected intraperitoneally once a week for 4 weeks to mimic cardiac fibrosis in LPS group and LPS+apocynin group.Apocynin was given in apocynin group and LPS+apocynin group,once a week for 4 weeks.Collagen fraction area of the left ventricle was measured with picrosirius red staining.The cardiac expression of fibrosis-related genes was measured by RT-PCR.The subunits gp91phoxand p67phoxof NADPH oxidase were analyzed by Western blot,ROS production was determined by DHE staining.ResultsThe cardiac fibrosis of mice occurred after 4 weeks.Compared with control group,the interstitial diffuse fibrous tissue in myocardium,the collagen volume fraction,the mRNA expression of LPS-induced activation of fibrosis-related genes ColⅠa1,ColⅢa1,MMP2 and MMP9,the expression gp91phoxand p67phoxand ROS production in LPS group were increased.Compared with LPS group,apocynin decreased the above indexes significantly (P<0.05).ConclusionApocynin can protect against the cardiac fibrosis in mice exposed to subclinical LPS by inhibiting the over-expression of myocardial gp91phoxand p67phox.

Lipopolysaccharide;Apocynin;NADPH oxidase;Fibrosis

2017-03-23

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，南京 210029

10.14053/j.cnki.ppcr.201710004