延胡索酸堿提取物HPLC指紋圖譜及主成分分析

金力薇，趙靈佳，岳顯可，陳薇娜，錢(qián) 敏，楊海燕

延胡索酸堿提取物HPLC指紋圖譜及主成分分析

金力薇1，趙靈佳1，岳顯可2,3*，陳薇娜3，錢(qián) 敏2，楊海燕3

目的建立延胡索不同濃度酸堿提取物的HPLC指紋圖譜，并結(jié)合主成分分析法(PCA)評(píng)價(jià)不同提取物中的化學(xué)組分。方法用氨水、冰醋酸配制不同濃度酸堿水溶液，供試品加熱回流提取；采用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈-0.6%醋酸溶液(pH 5.0)為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫25 ℃，流速1 mL/min，構(gòu)建HPLC指紋圖譜，用相似度軟件建立共有峰模式；應(yīng)用SPSS 19.0分析軟件，以主要色譜峰峰面積為變量進(jìn)行PCA分析。結(jié)果標(biāo)定了延胡索不同酸堿提取物HPLC指紋圖譜的16個(gè)共有峰，并指認(rèn)了其中6個(gè)共有峰，分別為原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素和紫堇堿，各批次延胡索提取物的相似度在0.861～0.984；PCA結(jié)果表明，前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到91.097%；選擇這3個(gè)因子對(duì)延胡索不同酸堿提取物進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)論HPLC指紋圖譜結(jié)合PCA可以快速、客觀地評(píng)價(jià)延胡索不同酸堿提取物的化學(xué)組分差異，并確定酸性溶液更適合延胡索生物堿類成分的提取。

延胡索；酸堿水溶液；指紋圖譜；主成分分析

0 引言

延胡索為罌粟殼植物延胡索Corydalisyanhusuo的干燥塊莖，別名元胡。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有兩千多年的歷史，用于胸痹心痛、脘腹疼痛、腰痛、疝氣痛、痛經(jīng)、閉經(jīng)、產(chǎn)后瘀滯腹痛、跌打損傷等[1]，為中藥復(fù)方制劑中的常用藥，在神經(jīng)系統(tǒng)[2]方面具有鎮(zhèn)痛[3]、鎮(zhèn)靜作用，在心血管系統(tǒng)方面有擴(kuò)張冠脈血管[4]、抗心律失常[5]、保護(hù)心肌細(xì)胞作用[6]。延胡索多以其醋制品入藥，醋制能使難溶于水的生物堿與醋結(jié)合成為易溶于水的醋酸鹽，從而增加延胡索在水煎液中的總生物堿含量[7]。為進(jìn)一步分析醋制對(duì)生物堿溶出的影響，排除炮制過(guò)程中熱作用帶來(lái)的影響，本研究以不同濃度酸堿水溶液為提取溶劑，對(duì)生延胡索片進(jìn)行提取。同時(shí)利用HPLC指紋圖譜整體、宏觀的分析特點(diǎn)[8]，結(jié)合主成分分析法，對(duì)延胡索不同濃度酸堿提取物中化學(xué)組分進(jìn)行分析。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 戴安UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)；Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；AL-204電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；DK-98-ⅡA數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥 新鮮延胡索藥材采自浙江金華東陽(yáng)，新鮮切片，烘干，為生延胡索片；原阿片堿(批號(hào)：110853-201003，純度99.9%)、鹽酸巴馬汀(批號(hào)：110732-201108，純度86.2%)、鹽酸小檗堿(批號(hào)：110713-200910，純度97.9%)、延胡索乙素(批號(hào)：110726-201112，純度99.6%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，去氫紫堇堿(批號(hào)：141207，純度98.12%)、紫堇堿(批號(hào)：150327，純度98.56%)購(gòu)自成都普非德生物技術(shù)有限公司；氨水、冰醋酸、甲醇、磷酸、三乙胺為分析純，液相用甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法

2.1 延胡索飲片的加工 新鮮延胡索采自浙江金華東陽(yáng)，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司質(zhì)檢科鑒定為罌粟科紫堇屬延胡索(CorydalisyanhusuoW.T.Wang)的塊莖，新鮮切片，烘干為生延胡索飲片，備用。

2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：乙腈A-0.6%醋酸溶液(三乙胺調(diào)pH至5.0)B梯度洗脫(洗脫條件：0～50 min，15%～50%A；50～70 min，50%～80% A；70～75 min，80% A)；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 延胡索混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖

2.3 對(duì)照品溶液的制備 稱取對(duì)照品原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素、紫堇堿適量，于20 mL量瓶中，加甲醇至刻度，溶解搖勻，制成含原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素、紫堇堿濃度分別為286.71、252.14、256.01、244.32、306.27、228.17 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備 稱取延胡索粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.5 g，于具塞三角錐形瓶中，精密加入水50 mL，稱重，冷浸1 h后加熱回流1 h，放冷，再稱重，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.5 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以延胡索乙素為參照峰，計(jì)算共有模式圖譜的相似度分別為0.999、0.998、0.999、0.997、0.998、0.999、0.997，RSD為0.09%，表明精密性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖。以延胡索乙素為參照峰，計(jì)算共有模式圖譜的相似度分別為0.996、0.999、0.997、0.998、0.999、0.998、0.999，RSD為0.12%，表明供試品溶液在0～10 h穩(wěn)定性良好。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批次延胡索粉末6份，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定記錄色譜圖。以延胡索乙素為參照峰，計(jì)算共有模式圖譜的相似度分別為0.997、0.995、0.996、0.999、0.995、0.996、0.998，RSD為0.15%，表明重現(xiàn)性良好。

2.8 延胡索酸堿提取物指紋圖譜建立

2.8.1 指紋圖譜的建立 稱取延胡索粉末約0.5 g，分別精密加入8.0%、4.0%、2.0%、1.0%、0.5%醋酸溶液，水，0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、8.0%氨水溶液各50 mL，按“2.4”項(xiàng)下方法繼續(xù)制備供試品溶液。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，得延胡索不同濃度酸堿提取物指紋圖譜。以AIA(*cdf)格式導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”，設(shè)定S1為參照?qǐng)D譜，對(duì)保留時(shí)間的色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹配，時(shí)間寬度為0.1 min，生成疊加圖，見(jiàn)圖2。

圖2 延胡索不同濃度酸堿提取物HPLC指紋圖譜疊加圖

2.8.2 共有峰標(biāo)定 根據(jù)11批延胡索提取物指紋圖譜，利用中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)的數(shù)據(jù)匹配功能，標(biāo)定16個(gè)共有指紋峰，見(jiàn)圖3。并指認(rèn)3號(hào)峰為原阿片堿、9號(hào)峰為鹽酸巴馬汀、10號(hào)峰為鹽酸小檗堿、11號(hào)峰為去氫紫堇堿、12號(hào)峰為延胡索乙素、13號(hào)峰為紫堇堿，其中延胡索乙素為參照峰。延胡索不同濃度酸堿提取物共有峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積見(jiàn)表1。

圖3 延胡索不同濃度酸堿提取物HPLC共有峰模式圖

2.8.3 延胡索酸堿提取物指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) S1～S5為延胡索酸提取物，S6為延胡索水提取物，S7～S10為延胡索堿提取物，以共有峰模式圖譜為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，各批次延胡索提取物的相似度在0.861～0.984，具體見(jiàn)表2。

2.9 主成分分析

2.9.1 特征值和方差貢獻(xiàn)率 應(yīng)用SPSS 19.0軟件，以主成分特征值及貢獻(xiàn)率為依據(jù)，對(duì)延胡索不同濃度酸堿提取物進(jìn)行主成分分析。由表3、圖4結(jié)果可知，其中第1、2、3主成分特征值分別為11.482、2.029、1.064，對(duì)應(yīng)的貢獻(xiàn)率分別為71.765%、12.679%、6.652%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為91.097%。

表1 各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積統(tǒng)計(jì)表

表2 延胡索不同酸堿溶劑提取物相似度分析

表3 特征值和方差貢獻(xiàn)率

圖4 碎石圖

由表4可知，第1主成分主要反映原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素、紫堇堿和1、4、5、6、7、8號(hào)峰的主要信息，第2主成分主要反映2、14、15、16號(hào)峰的信息。

以第1、第2、第3主成分為變量得到的三維投影圖載荷圖(圖4)，在投影圖中距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的幾個(gè)點(diǎn)就是主成分1和2中權(quán)重較大的成分，對(duì)區(qū)分延胡索不同濃度酸堿提取物中起的作用較大。

2.9.2 延胡索酸堿提取物主成分得分、綜合得分及排名 以選擇的3個(gè)主成分貢獻(xiàn)率為權(quán)重系數(shù)，對(duì)延胡索不同濃度酸堿提取物進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，計(jì)算主成分得分及綜合得分，見(jiàn)表5。其中酸濃度越大，其主成分1得分和綜合得分越高，而主成分1主要反映原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素、紫堇堿和成分1、4、5、6、7、8等，說(shuō)明酸提取物中生物堿類成分豐富且含量高；延胡索水提取物中化學(xué)組分及含量較酸提取物低；弱堿溶液抑制延胡索生物堿成分的溶出，然而，隨著堿濃度增大，延胡索生物堿溶出先增加后又下降。

表4 成分載荷矩陣

圖5 載荷圖

表5 延胡索不同溶劑提取物主成分得分、綜合得分及排名

3 討論

不同地區(qū)延胡索醋制方法和工藝有一定區(qū)別，如醋煮、醋蒸、醋炙，在這個(gè)炮制過(guò)程中，生物堿含量的變化，除了輔料帶來(lái)的影響，也不能排除熱作用對(duì)藥材組織的進(jìn)一步破壞導(dǎo)致化學(xué)成分的溶出。本研究以生延胡索片為實(shí)驗(yàn)材料，著重考察酸堿度對(duì)生物堿溶出的影響。通過(guò)HPLC指紋圖譜結(jié)合主成分分析法，對(duì)延胡索不同濃度酸堿提取物的化學(xué)組分進(jìn)行分析，標(biāo)定了16個(gè)共有峰，并指認(rèn)了原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素和紫堇堿，延胡索不同濃度酸堿提取物的相似度在0.861～0.984；主成分分析篩選了3個(gè)主成分，其中第1主成分貢獻(xiàn)率為71.765%，第2主成分貢獻(xiàn)率為12.679%，第3主成分貢獻(xiàn)率為6.652%，進(jìn)而計(jì)算得到主成分得分和綜合得分。延胡索在醋酸溶液中的化學(xué)成分，特別是生物堿類成分的提取效果較好，也進(jìn)一步驗(yàn)證了經(jīng)醋制后，延胡索生物堿與醋酸結(jié)合成易溶于水的醋酸鹽，從而更好地發(fā)揮藥效。

近年來(lái)，醫(yī)院、患者服用免煎配方顆粒的比重越來(lái)越大。然而，配方顆粒的投料必須是對(duì)應(yīng)的飲片，比如醋延胡索顆粒必須是醋延胡索飲片經(jīng)提取而得，類似的其他酒制、鹽制還很多。如果在提取過(guò)程中可以直接用生藥和相應(yīng)的溶劑提取，則可以減少反復(fù)加工帶來(lái)的成分流失，也可以減少工序從而降低成本。本研究結(jié)果也為此設(shè)想提供初步的數(shù)據(jù)支持。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部) [S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:139.

[2] 姜海波,王軍,蘇建華,等.延胡索乙素對(duì)小鼠坐骨神經(jīng)CCI模型背根神經(jīng)節(jié)Cav1.2表達(dá)的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2015,31(11):1598-1603.

[3] 冷文婷,王殊秀,冷玉芳,等.延胡索乙素分別與URB597和URB602聯(lián)合應(yīng)用對(duì)CCI大鼠鎮(zhèn)痛作用的研究[J].中國(guó)疼痛醫(yī)學(xué)雜志,2012,18(12):735-738.

[4] 俞靜,花寶金,樸炳奎.延胡索乙素對(duì)放射所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].中華腫瘤防治雜志,2011,18(8):584-587,601.

[5] 張萍,徐鳳芹,馬曉昌,等.延胡索堿治療快速性心律失常的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012,32(5):713-716.

[6] 程星燁,石鉞.延胡索抗心肌缺血活性部位指紋圖譜中化學(xué)成分分析[J].中國(guó)中藥雜志,2008,33(14):1717-1719.

[7] 雷云,李先端,楊洪軍,等.基于成分分析和活性評(píng)價(jià)的延胡索醋制的研究[J].中草藥,2013,44(21):2992-2996.

[8] 游修琪,顧雪竹,毛淑杰,等.延胡索產(chǎn)地不同加工品HPLC指紋圖譜研究[J].中成藥,2009,31(10):1481-1484.

HPLCfingerprintingandprincipalcomponentanalysisofRhizomacorydalisacidandalkaliextracts

JIN Li-wei1,ZHAO Ling-jia1,YUE Xian-ke2,3*,CHEN Wei-na3,QIAN Min2,YANG Hai-yan3

(1.the First People′s Hospital of Wenling,Wenling 317500,China;2.Zhejiang Chinese Medical University Medical Pieces,. LTD,Hangzhou 311401,China;3.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China)

ObjectiveTo evaluate the contents of the chemical composition ofRhizomacorydalisacid and alkali extracts by HPLC fingerprint combined with principal component analysis (PCA).MethodsDifferent concentrations of acid and alkali aqueous solution were made up by ammonium hydroxide and acetic acid.Test sample solution was prepared by heating reflux.The chromatographic conditions were as follows:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),linear gradient elution of acetonitrile-0.6% acetate solution (pH 5.0).The detection wavelength was 280 nm.The column temperature was 25 ℃,flow rate 1 mL/min.The common mode of HPLC fingerprints ofRhizomacorydalisextracts was established with similarity evaluation software.SPSS 19.0 software was used for PCA analysis with the common peaks area as variables.ResultsThe common mode of the HPLC characteristic chromatographic profile was set up with 16 common peaks,and 6 of the common peaks was identified as protopine,palmatine hydrochloride,berberine hydrochloride,dehydrocorydaline,tetrahydropalmatine and corydaline.The similarity ofRhizomacorydalisextracts was 0.861～0.984.The PCA results showed that accumulative contribution of first three factors was up to 91.097%,which were chosen to comprehensively evaluate theRhizomacorydalisacid and alkali extracts.ConclusionHPLC combined with PCA can quickly and objectively evaluate the difference in chemical composition ofRhizomacorydalisacid and alkali extracts,and alkali aqueous solution is more suitable for extractingRhizomacorydalis.

Rhizomacorydalis;Acid and alkali aqueous solution;Fingerprint;Principal component analysis

2017-02-04

1.溫嶺市第一人民醫(yī)院，浙江 溫嶺 317500；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，杭州 311401；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053

杭州市衛(wèi)生科技計(jì)劃(一般)項(xiàng)目(2015A39)

*

10.14053/j.cnki.ppcr.201710021