中國(guó)蘭花苞基因組DNA的提取及優(yōu)化

林成立

(福建省林業(yè)科技試驗(yàn)中心，福建 南靖 363600)

DNA是生物遺傳信息的載體和主要的遺傳物質(zhì)。隨著分子生物學(xué)在花卉研究中的廣泛應(yīng)用，花卉的基因組測(cè)序、分子輔助育種、遺傳工程等研究不斷深入[1-3]。目前已有許多物種的DNA提取方法被開(kāi)發(fā)并成功應(yīng)用，如菊花[4]、大花蕙蘭[5]、茉莉花[6]、梅花[7]、紅掌[8]、獼猴桃[9]等植物的DNA提取方法已見(jiàn)報(bào)道。高質(zhì)量的基因組DNA是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，但不同生物學(xué)材料的物質(zhì)組成及含量不同，使得DNA的提取方法不同。去除多糖、多酚等雜質(zhì)是提取高質(zhì)量DNA的主要難題。多糖、多酚易與DNA形成難溶復(fù)合物，且多酚氧化后會(huì)形成不可逆褐色產(chǎn)物，干擾DNA的絮狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取質(zhì)量不佳。目前，已有許多學(xué)者提出了去除多糖、多酚等雜質(zhì)的解決辦法。閆玖英等[10]采用細(xì)胞裂解前加入干擾物清洗液，提高β-巰基乙醇和PVP濃度抑制多酚氧化，沉淀DNA時(shí)加入1/10體積3 mol·L-1NaAC，可有效去除果實(shí)中多糖和多酚等物質(zhì)；謝志亮等[11]在異丙醇沉淀DNA前加入5 mol·L-1NaCl可有效去除多糖；張妙彬等[12]通過(guò)細(xì)胞裂解前加入清洗液獲得石斛基因組DNA；李建光等[13]利用多糖高鹽溶解原理成功獲得蛇皮果高質(zhì)量的基因組DNA。

國(guó)蘭是原產(chǎn)于中國(guó)的蘭屬(Cymbidium)地生蘭類植物，其葉片DNA提取方法已見(jiàn)報(bào)道[14]。但采摘蘭花葉片對(duì)植株生長(zhǎng)影響較大，尤其是部分稀有或名貴品種，而采摘花苞對(duì)植株生長(zhǎng)的影響較小，可作為國(guó)蘭基因組DNA提取的首選材料。目前有關(guān)國(guó)蘭花苞DNA提取的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本文以墨蘭‘企黑’為試材，在常規(guī)CTAB提取法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，探索國(guó)蘭花苞高質(zhì)量基因組DNA的提取方法，以期為國(guó)蘭全基因DNA獲取提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

墨蘭‘企黑’采自福建省林業(yè)科技試驗(yàn)中心蘭花種質(zhì)資源圃。采摘新鮮花苞，液氮速凍，于-80 ℃冰箱保存，備用。洗凈液：0.4 mol·L-1葡萄糖+3%可溶性PVP+10 mmol·L-1β-巰基乙醇；常規(guī)CTAB法裂解緩沖液：100 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)+20 mmol·L-1EDTA(pH8.0)+0.5 mol·L-1NaCl+1.5%SDS+10 mL·L-1β-巰基乙醇(現(xiàn)用現(xiàn)加)；改良CTAB法裂解緩沖液：100 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)+20 mmol·L-1EDTA(pH8.0)+0.5 mol·L-1NaCl+1.5%SDS；體積比為24∶1的氯仿/異戊醇；5 mol·L-1NaCl溶液；TE緩沖液：10 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)+1 mmol·L-1EDTA(pH8.0)。

1.2 DNA提取方法

1.2.1 常規(guī)的CTAB提取法 稱取0.1 g花苞，用液氮充分研磨成粉末，快速轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管。用移液槍加入600 μL經(jīng)70 ℃預(yù)熱的DNA裂解緩沖液，充分混勻，放入70 ℃水浴鍋水浴30 min，每隔5 min上下顛倒離心管，使細(xì)胞充分裂解。水浴后加入600 μL氯仿/異戊醇溶液，混勻，靜置10 min后以12 000 r·min-1離心10 min。取上清液至1.5 mL離心管并加入等體積異丙醇，混勻后可見(jiàn)絮狀物，靜置5 min，4 ℃下10 000 r·min-1離心5 min。棄上清液，加入200 μL 75%酒精清洗沉淀，4 ℃下3 000 r·min-1離心1 min(重復(fù)1次)，充分晾干后溶解于TE緩沖溶液中，于-40 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 改良的CTAB提取法 稱取0.1 g花苞，用液氮充分研磨成粉末，加入1 mL 洗凈液繼續(xù)研磨至糊狀后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，常溫下以13 000 r·min-1離心10 min。用移液槍將膠狀物迅速吸出(底部沉淀與上清液間)，加入600 μL裂解緩沖液和150 μL無(wú)水乙醇，充分混勻后于70 ℃水浴鍋水浴30 min，每隔5 min上下顛倒混勻。水浴后加入600 μL氯仿/異戊醇溶液，靜置10 min，常溫下以13 000 r·min-1離心10 min。取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇溶液，靜置10 min，常溫下以13 000 r·min-1離心10 min。取上清液并轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，加入等體積異丙醇和1/2體積5 mol·L-1NaCl溶液(進(jìn)一步去除多糖和多酚類物質(zhì)[13])，混勻，常溫下靜置5 min。4 ℃下10 000 r·min-1離心5 min。棄上清液，加入200 μL 75%酒精清洗沉淀，4 ℃下3 000 r·min-1離心1 min(重復(fù)1次)，充分晾干后溶解于TE緩沖溶液中，于-40 ℃冰箱保存，備用。

1.3 DNA質(zhì)量檢測(cè)

取3 μL DNA提取物與2 μL Loading buffer混勻，在1%瓊脂糖凝膠中電泳30 min(電泳儀型號(hào)：BIO-RAD PowerPac Universal；電泳緩沖液：1×TAE；電泳電壓：150 V)。使用電泳凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)：BIO-RAD Gel DOCTMXR+)檢測(cè)DNA的完整性。使用超微量核酸測(cè)定儀(型號(hào)：Thermo NANODROP ONE)測(cè)定DNA的提取濃度、D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm。

1.4 PCR擴(kuò)增

選擇ISSR分子標(biāo)記引物UBC842為引物，對(duì)DNA提取物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)(PCR儀型號(hào)：BIO-RAD T100TM)。20 μL反應(yīng)體系為：60 ng DNA模板，0.25 μL引物(10 mmol·L-1,北京六合華大基因科技有限公司)，10 μL 2×Taq PCR SuperMix預(yù)混酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，無(wú)菌水補(bǔ)足至20 μL； PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性45 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，45個(gè)循環(huán)，72 ℃充分延伸5 min，4 ℃待機(jī)保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 墨蘭‘企黑’花苞基因組DNA提取濃度及質(zhì)量檢測(cè)

A.常規(guī)CTAB法；B.改良CTAB法。圖1 DNA提取物電泳圖Figure 1 Electropherograms of extracted DNA

墨蘭‘企黑’花苞基因組DNA電泳圖見(jiàn)圖1，其提取物質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。采用常規(guī)CTAB法提取‘企黑’花苞DNA，發(fā)現(xiàn)大部分DNA抱團(tuán)滯留在樣孔中(圖1A)；DNA提取物濃度高達(dá)1 837.5～2 024.5 ng·μL-1，但3個(gè)試樣DNA提取物的D260 nm/D280 nm均<1.5，D260 nm/D230 nm均<0.8(表1)，表明DNA可能被蛋白質(zhì)、多糖、多酚等雜質(zhì)污染，提取物粘稠，甚至膠狀抱團(tuán)。采用改良的CTAB法提取‘企黑’花苞DNA，其電泳圖(圖1B)顯示DNA條帶清晰、無(wú)拖帶、無(wú)RNA污染；D260 nm/D280 nm介于1.78～1.81之間，D260 nm/D230 nm介于1.99～2.12之間，DNA濃度為216.5～245.8 ng·μL-1(表1)，說(shuō)明改良CTAB法提取的DNA濃度低于常規(guī)方法。這主要由于純化步驟造成一部分DNA損失，但改良后的提取濃度足以滿足大部分分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求[5，13-14]。

表1 DNA提取產(chǎn)物質(zhì)量檢測(cè)Table 1 Quality testing of extracted DNA

1)編號(hào)對(duì)應(yīng)圖1電泳圖泳道。

2.2 PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)

圖2 PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)電泳圖Figure 2 Electropherograms of amplified PCR products

PCR擴(kuò)增是大多數(shù)分子標(biāo)記、基因克隆等分子生物學(xué)研究的技術(shù)基礎(chǔ)，DNA提取物質(zhì)量合格與否直接影響PCR擴(kuò)增的成敗。為進(jìn)一步檢驗(yàn)改良CTAB法提取的‘企黑’花苞基因組DNA質(zhì)量，采用ISSR分子標(biāo)記引物UBC842進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)(圖2)。由圖2可知，PCR擴(kuò)增條帶清晰、無(wú)拖帶，表明采用該方法提取的DNA質(zhì)量合格，可以作為后續(xù)分子標(biāo)記、基因克隆等分子生物學(xué)研究的PCR擴(kuò)增模板。

3 討論

國(guó)蘭花苞富含多糖、多酚等次生代謝物質(zhì)，提取過(guò)程中易出現(xiàn)抱團(tuán)成膠、提取產(chǎn)物粘稠、電泳時(shí)DNA滯留在樣孔中等問(wèn)題。本研究采用常規(guī)CTAB法提取墨蘭‘企黑’DNA，發(fā)現(xiàn)使用異丙醇沉淀核酸后出現(xiàn)沉淀抱團(tuán)成膠、無(wú)法溶解的現(xiàn)象，這主要是由于花苞中可能含有易包裹DNA的多糖物質(zhì)，使得DNA難以溶解。且提取過(guò)程中，多酚類物質(zhì)與不可逆氧化成醌類物質(zhì)發(fā)生褐變，而與DNA結(jié)合成不可逆復(fù)合物，導(dǎo)致DNA純度下降。為了解決上述問(wèn)題，本研究利用活細(xì)胞中細(xì)胞區(qū)室化，多糖、多酚及其他雜質(zhì)與DNA相互隔離的原理[15]，在裂解細(xì)胞核前加入洗凈液以除去細(xì)胞質(zhì)中大部分組分，發(fā)現(xiàn)改良后的CTAB法可有效防止多酚類物質(zhì)被氧化，提取到高質(zhì)量的國(guó)蘭花苞基因組DNA。

多糖與DNA具有相似的理化性質(zhì)，易與DNA一起沉淀，影響DNA的提取。但除去多糖的同時(shí)也容易帶走DNA，從而降低提取率。CTAB提取法是一種低成本、低毒、操作簡(jiǎn)單的DNA提取方法，針對(duì)不同材料進(jìn)行一定程度的優(yōu)化均能取得不錯(cuò)的效果[9]。本研究表明，僅在細(xì)胞裂解前加入洗凈液，提取產(chǎn)物依然存在一定程度的粘稠及拖帶現(xiàn)象。低濃度乙醇(10%～30%)可以沉淀多糖[16-17]及在沉淀DNA的同時(shí)加入1/2體積NaCl(5 mol·L-1)能有效去除多糖[18]。本研究在裂解細(xì)胞核離心后，加入1/4體積的無(wú)水乙醇，以沉淀上清液中的多糖，并在沉淀DNA的同時(shí)加入1/2體積NaCl(5 mol·L-1)以充分去除多糖。該方法可以有效提取高質(zhì)量的國(guó)蘭花苞基因組DNA。