靈武長棗蔗糖含量的高光譜無損檢測

程麗娟，劉貴珊，何建國,*，楊曉玉，萬國玲，張 翀，馬 超

（1.寧夏大學農(nóng)學院，農(nóng)產(chǎn)品無損檢測實驗室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學物理與電子電氣工程學院，寧夏 銀川 750021）

靈武長棗是寧夏獨有的鮮食棗品種，富含維生素、礦物質[1]。棗果實具有食療作用，可當作補血藥和保健補血劑[2-3]。糖度是評價棗品質的首要指標和長棗中重要的風味物質，影響著棗果實的成熟度。棗內部的糖分主要為蔗糖、果糖和葡萄糖，而果實中糖累積的最主要形式是蔗糖，在酶的作用下可轉化成其他2種糖[4]。糖含量的傳統(tǒng)檢測方法有折射儀、糖度計、蒽酮法等[5-7]，屬于有損檢測且費時費力。需尋找一種無損且快速測定果品糖含量的方法，對于完善長棗品質評價有重大的現(xiàn)實意義。

高光譜成像技術可將光譜和圖像相結合[8]，呈現(xiàn)出無損、快捷靈敏、精確度高等優(yōu)點[9]，是果品品質無損檢測的發(fā)展趨勢，對果品的研究集中在蟲害檢測、分類判別、農(nóng)藥殘留、揮發(fā)性成分、內部品質檢測等方面[10-14]；Guo Ying等[15]使用4 種建模方法對棗內部物質建立預測模型，得到最佳模型為最小二乘支持向量機，表明光譜技術結合化學計量學是一種快速實用的技術；Ma Te等[16]利用近紅外光譜對蘋果中的可溶性固形物含量進行檢測，建立偏最小二乘回歸分析，預測值的決定系數(shù)（R2）為0.89，交叉驗證均方根誤差（root mean square error of cross-validation，RMSECV）為0.55%；Hu Weihong等[17]用1-MCP處理獼猴桃，使用可見-近紅外系統(tǒng)記錄1-MCP處理組和對照組的高光譜圖像，建立糖含量的穩(wěn)健模型，果實中葡萄糖、果糖和蔗糖的最佳預測精度分別為0.934、0.867和0.705；Gomes等[18]基于高光譜成像系統(tǒng)測試2012年和2013年葡萄中的糖含量，對于2012年采集的樣本，偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）和神經(jīng)網(wǎng)絡的均方根誤差分別為0.94 °Brix和0.96 °Brix，決定系數(shù)（R2）分別為0.93和0.92，2013年樣本均方根誤差值分別為1.34 °Brix和1.35 °Brix，R2分別為0.95和0.92；于慧春等[19]利用光譜成像技術結合誤差反向傳播算法神經(jīng)網(wǎng)絡檢測不同波段的枸杞多糖和總糖含量，枸杞總糖含量預測正確率達到100%，相關系數(shù)為0.996 8； 管曉梅等[20]采集蘋果的高光譜數(shù)據(jù)，引進一種優(yōu)化偏最小二乘因子數(shù)的方法，果糖含量預測集均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）和相關系數(shù)（RP）分別由0.657、0.828改善至0.604、0.871；馮迪等[21]利用高光譜成像技術同時提取檢測蘋果糖度與硬度的最佳波長，結果顯示，糖度相關系數(shù)為0.847 6，均方根誤差為3.32；李瑞等[22]采用近紅外光譜儀（900～1 700 nm）測量藍莓果實的硬度和糖度，結果表明，糖度校正集相關系數(shù)RC和驗證集相關系數(shù)RP達到0.891和0.774；劉燕德等[23]研究蘋果中的可溶性固形物和糖酸比，可溶性固形物預測模型的相關系數(shù)達到0.936，預測均方根誤差為0.476 °Brix。以上研究表明利用高光譜技術檢測靈武長棗蔗糖含量理論上具有可行性。

本實驗以靈武長棗為研究對象，利用可見-近紅外高光譜采集長棗圖像并建模分析，優(yōu)選最佳模型，為更深一步探討靈武長棗的內部品質提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈武長棗購于寧夏靈武果業(yè)開發(fā)有限責任公司，選取147 個長棗樣本4 ℃冷藏。每隔5 d測試1 次，共計7 次，每次隨機取21 個長棗作為實驗樣本，將長棗擦拭干凈，按照編號依次鋪在平板上，掃描樣本光譜圖像。

蔗糖標品 四川省維克奇生物科技有限公司；水系膜（0.45 μm×50 mm）、濾頭（0.45 μm）、乙醇（色譜級） 天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

AGILENT型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配有示差檢測器和Aminex HPX-87H糖分析柱） 美國安捷倫科技公司；VIS/NIR高光譜成像系統(tǒng)（光譜范圍400～1 000 nm，共包含125 個波段） 北京卓立漢光儀器有限公司；高光譜成像光譜儀 芬蘭Spectral Imaging公司；CCD攝像機日本Hamamatsu公司；4 個150 W的光纖鹵素燈 美國Schott公司；電控位移平臺 北京Zolix公司。

1.3 方法

1.3.1 高光譜信息采集

高光譜系統(tǒng)預熱0.5 h后方可進行實驗[24]，由于傳感器內部雜質與CCD相機中的芯片會因熱激發(fā)生成電子，對圖像來說屬于噪聲，因此需要校正處理[25]，其計算公式如下：

式中：R為黑白校正后的長棗光譜；IR為長棗原始光譜；ID為黑板光譜；IW為白板光譜。

為避免光譜圖像失真，需要對高光譜成像系統(tǒng)進行參數(shù)設置[26]，最終掃描參數(shù)設置為：CCD相機曝光時間20 ms；物鏡高度385 mm；掃描長度70 mm；電控位移平臺速率200 μm/s。

1.3.2 HPLC測定長棗蔗糖含量

標準溶液的配制：準確稱取蔗糖標準品100 mg（精確至0.000 1 g），加少量超純水溶解，定容至5 mL容量瓶內，制成質量濃度為20 mg/mL溶液。準確吸取蔗糖溶液2 mL于5 mL容量瓶中定容，制備成蔗糖質量濃度為8 mg/mL溶液。同時按照對應比例稀釋制備蔗糖質量濃度均為0.5、1、2、4、8 mg/mL標準溶液。

提取液的制備：采集長棗樣品光譜后，削去果皮，將10 mL無水乙醇加入研磨搗碎后的1 g果肉中先進行均質，超聲提取0.5 h，11 000 r/min離心15 min后收集上清液，然后將5 mL無水乙醇加入殘渣中再次提取。以上處理得到的上清液合并，55 ℃真空旋干，加入超純水溶解并定容到25 mL容量瓶刻度線位置，充分搖勻，測試前用0.45 μm針式過濾器過濾。流動相為超純水進行反復測試，最終確定HPLC條件：進樣量10 μL，流速0.4 mL/min，等度洗脫，柱溫30 ℃，示差折光檢測器溫度35 ℃。

1.3.3 光譜數(shù)據(jù)處理

利用ENVI4.8軟件分別從每張長棗光譜圖像的赤道部位且呈相同暗紅顏色的部位提取30 pixel×30 pixel的感興趣區(qū)域（region of interest，ROI），計算每張ROI的平均光譜值并作為該長棗的反射光譜。將光譜值和化學值建立模型，利用蒙特卡洛交叉驗證法檢測、剔除異常值；光譜理化值共生距離法劃分樣本；在光譜采集過程中，由于存在儀器噪音、暗電流等影響因素，易使光譜曲線產(chǎn)生不重復和基線漂移等現(xiàn)象[27]，故有必要在模型建立前對原始光譜進行正交信號校正（orthogonal signal correction，OSC）法、多元散射校正（multiple scattering correction，MSC）、S-G卷積平滑（savitzkygolay，SG）、中值濾波（median-filter，MF）、高值濾波（Gaussian-filter，GF）、基線校準、去趨勢7 種預處理；為減少數(shù)據(jù)量，提高運算速度，采用競爭性自適應加權（competitive adaptive reweighted sampling，CARS）算法、連續(xù)投影算法（successive projection algorithm，SPA）和無信息消除變量（uninformative variable elimination，UVE）3 種數(shù)據(jù)降維方法提取特征變量，以期實現(xiàn)少數(shù)波段代替全波段；將全波段光譜（full spectrum，F(xiàn)S）以及CARS、UVE、SPA、CARS+SPA和CARS+UVE 5 種方法提取的特征波長分別建立主成分回歸（principle component regression，PCR）、PLSR和多元線性回歸（multivariable linear regression，MLR）模型，對比分析不同方法對靈武長棗蔗糖含量預測模型的影響，從而確定最優(yōu)的建模模型。

1.3.4 模型評價

由相關系數(shù)（correlation coefficient，R）、校正集均方根誤差（root mean square error of calibration set，RMSEC）、RMSECV以及預測集均方根誤差（root mean square error of prediction set，RMSEP）、RC+RP評價模型穩(wěn)定性[28]。實驗流程見圖1。

圖1 實驗流程圖Fig. 1 Flow chart of data processing

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖像處理

高光譜圖像分析軟件為ENVI 4.8（Research System Inc，USA），原始光譜預處理以及PLSR、PCR、MLR建模使用The Unscrambler X 10.4軟件，特征波長提取使用Matlab R2014a軟件，繪圖軟件為Origin。

2 結果與分析

2.1 HPLC結果

2.1.1 蔗糖標準曲線

圖2 蔗糖標品（a）與長棗提取液（b）的HPLLCC圖Fig. 2 HPLC peak of sucrose (a) and jujube (b)

由圖2可知，蔗糖出峰時間為11.37 min。蔗糖標準曲線方程為y=4.577 6×10－6x－2.48×10－2（y為蔗糖質量濃度，x為峰面積），相關系數(shù)R2=0.999 9，表明兩者具有良好的線性相關性。

2.1.2 精密度測定結果

由表1可知，樣品的峰面積基本穩(wěn)定，通過計算得到相對標準偏差為0.27%小于1%，表明該方法精密度高。

表1 精密度結果Table 1 Precision of the HPLC method

2.1.3 加標回收率測定結果

由表2可知，加標回收率為93.09%～98.47%，平均回收率為95.18%，有較高的準確性。

表2 加標回收率結果Table 2 Recoveries of spiked samples

2.2 原始光譜數(shù)據(jù)采集結果

樣本圖像經(jīng)高光譜成像儀采集之后，選擇圖像中的平均光譜信息值作為原始反射光譜，如圖3所示。在675 nm波長附近，光譜反射值達到最低，是由于長棗樣本的C—H伸縮振動；900～1 000 nm之間的吸收峰主要由靈武長棗內部水分的吸收引起，該波段為水中O—H基團的二倍頻特征吸收峰[29]。

圖3 原始光譜反射曲線Fig. 3 Ref l ectance curves of original spectra

2.3 異常值檢測與剔除結果

異常值會影響數(shù)據(jù)的準確度[30]，因此本實驗利用蒙特卡洛方法檢測異常數(shù)據(jù)，預處理方法為Mean center；抽樣次數(shù)為2 000，建立147 個長棗的PLSR模型，由RMSECV最小確定最佳主成分數(shù)。如圖4所示，共檢測出4 個異常樣本，分別為：3號、16號、123號、138號樣本，剔除異常樣本后，相關系數(shù)RC由0.611增大到0.846，RMSECV由0.023 mg/g減小到0.021 mg/g。

圖4 基于蒙特卡洛方法檢測異常樣本Fig. 4 Detection of abnormal samples based on Monte Carlo method

2.4 樣本集劃分結果

采用Galvao等[31]提出的光譜理化值共生距離算法按照3∶1的比例將剔完異常值后的143 個樣本劃分成105 個校正集和38 個預測集，結果見表3，校正集的蔗糖質量濃度范圍大于預測集質量濃度范圍，表明樣本劃分合理。

表3 長棗蔗糖含量數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 3 Statistics of sucrose content in jujubes

2.5 光譜預處理

利用The Unscrambler X10.4軟件對原始光譜進行預處理，由表4可以看出，使用不同預處理方法，模型的穩(wěn)健性和模型性能均發(fā)生不同程度上的改變，所用預處理方法建立的PLSR模型中，校正集的相關系數(shù)RC均在0.8～0.9范圍內且基本接近，但是預測集的相關系數(shù)RP差異較大，其中，經(jīng)OSC預處理之后模型所建立的PLSR預測模型參數(shù)最優(yōu)，校正集和原始光譜相差不大，預測集有著更高的相關系數(shù)和更低的均方根誤差，模型相關系數(shù)RC為0.853、RP為0.794，因此，后續(xù)模型的建立都采用OSC預處理方法。OSC預處理方法效果好的原因是利用數(shù)學上正交的辦法，將原始光譜矩陣X中與待測品質Y不相關的部分信息濾除，能確保被濾除掉的信息與待測品質無關[32]。

表4 不同預處理方法的PLSR模型Table 4 PLSR models with different spectral pretreatments

2.6 光譜數(shù)據(jù)降維結果

2.6.1 SPA選取特征波長

SPA[33]是一種消除變量共線性的算法，可以在很大程度上精簡模型。采用SPA從125 個波段中選出了5 個最優(yōu)波長數(shù)。分別為401、410、425、439、723 nm，特征波長占總波長的4%。

2.6.2 UVE提取特征變量

圖5 UVE-PLSR穩(wěn)定性分布曲線Fig. 5 Stability distribution curve of UVE-PLSR model

使用UVE[34]提取長棗光譜特征波長，在分組數(shù)定為10的情況下得到RMSECV最小值對應的主成分數(shù)為10，圖5為125 個輸入變量的穩(wěn)定性結果，兩條水平虛線為變量的選擇閾值（±4.26）。選擇特征波長時內部信息認為是無用信息而被消除，外面的信息為有用信息，相對應的波長被選擇為特征波長。用此方法共選取21 個特征波長，分別為401、415、607、612、617、622、627、641、646、651、694、795、843、847、895、900、915、919、939、963、972 nm，特征波長占總波長的24.8%。

2.6.3 CARS[35]提取特征波長

圖6 CARS法選取波長變量過程Fig. 6 Selection of characteristic wavelength variables by CARS method

如圖6所示，設定運行次數(shù)為200。圖6a為篩選特征變量數(shù)的過程，隨著運行次數(shù)的加大，變量數(shù)呈現(xiàn)由快到慢的遞減趨勢，最后下降幅度趨于平緩；由圖6b可知，起初所建模型的RMSECV值不斷減小，說明采樣過程中，無用變量被消除，隨著運行次數(shù)的增加，RMSECV值基本穩(wěn)定，表明變量變化不明顯，之后RMSECV隨著采樣次數(shù)的增加而持續(xù)上升，說明一些關鍵變量數(shù)被消除；圖6c中的每條線代表回歸系數(shù)的變化趨勢，虛線A1、A2、A3、A4處的RMSECV值增大，是由于變量B1、B2、B3、B4的回歸系數(shù)值降低為0。CARS選出的17 個特征波長分別為449、497、511、550、622、684、703、708、775、838、852、862、881、892、939、948、987 nm，特征變量數(shù)縮減為原來的13.6%。

2.7 模型建立結果

使用PLSR、PCR、MLR建模方法，建立FS和特征波段的模型，見表5。FS-PLSR、FS-PCR和FS-MLR模型對應的RMSECV最小值為0.025、0.027 mg/g和0.029 mg/g，遠大于3 種特征波長建模結果。表明篩選的特征波長建模預測效果較好，原因可能是全波段光譜中包含了大量與長棗蔗糖含量無關的信息，降低了建模效果。

3 種單一特征波長的9 種建模中，校正集和預測集結果非常相近，說明以上3 種提取特征變量的方法是有效的，所建立的模型穩(wěn)定性也好，相比而言，采用CARS提取特征變量后建模結果優(yōu)于UVE和SPA。對于CARS+SPA、CARS+UVE特征波長疊加的模型，雖然提取出的波長數(shù)減少，但是3 種建模效果都不佳，因此，選取最優(yōu)模型為CARS-PCR，RC、RP為0.861和0.843。RC+RP表示模型穩(wěn)定性，大于其他模型穩(wěn)定性。

表5 不同波長提取方法建立的PLS和PCR模型的結果Table 5 Figures of merit of PLS and PCR models based on different wavelength extraction methods

3 結 論

以147 個靈武長棗為研究對象，利用可見-近紅外高光譜靈武長棗光譜圖像，提取反射光譜；對剔除異常樣本后的光譜使用7 種預處理，采用OSC方法對光譜預處理得到模型的效果最好，RC和RP分別為0.853和0.794，說明預處理方法對原始光譜進行正交信號校正處理可以降低噪音，獲取更多的有用信息信息，提高建模效果；利用SPA、UVE、CARS、CARS+SPA和CARS+UVE三種方法提取了5、21、17、10、18 個特征變量，占全波段的4%、24.8%、13.6%、8%、14.4%，對PLSR、PCR、MLR方法建立的18 種模型對比分析，結果發(fā)現(xiàn)，全波段模型效果差，可能是全波段光譜中包含了大量與長棗蔗糖含量無關的光譜信息；OSC-CARS-PCR方法建立的模型效果最好，RC、RP分別為0.861和0.843，RMSEC和RMSEP分別為0.013 mg/g和0.014 mg/g。綜上，利用高光譜圖像技術結合化學計量學方法實現(xiàn)長棗蔗糖含量的無損檢測具有可行性，為進一步完善長棗品質評價提供依據(jù)。