趙 鳳,許 萍,曾詩(shī)雨,楊 興,*
(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所,貴州 貴陽(yáng) 550025;2.通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)(上海)有限公司農(nóng)產(chǎn)食品部,上海 200030)
發(fā)酵酸魚(yú)是貴州侗族的傳統(tǒng)美食之一,其腌制方式獨(dú)特,味道香美[1],深受當(dāng)?shù)鼐用竦南矏?ài),也是招待客人的美味佳肴,具有豐富的飲食文化內(nèi)涵[2]。其制作方式簡(jiǎn)單,只需將魚(yú)肉放在干凈的容器內(nèi)魚(yú)與糯米粉交替平鋪,然后在適宜的溫度下進(jìn)行密封發(fā)酵。鱘魚(yú)是貴州山區(qū)的特色冷水魚(yú),目前主要以鮮活銷(xiāo)售為主,為填補(bǔ)鱘魚(yú)加工市場(chǎng)的空白,需開(kāi)發(fā)一種發(fā)酵鱘魚(yú)產(chǎn)品。
揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)較多,包括酸類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)、芳香烴、酚類(lèi)等,其中酸、醇、酯、酮、醛具有較低的閾值,對(duì)風(fēng)味的形成具有重要作用,因此檢測(cè)食品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)非常重要,尤其是對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品等氣味顯著的食品。
固相微萃?。╯olid phase micro-extraction,SPME)的主要特點(diǎn)是樣品需求量少、溶劑消耗少、靈敏度高、重復(fù)性和線性好,而且還可以將采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣集為一體,操作簡(jiǎn)單快捷,結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用可以萃取和分析鑒定很多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[3]。目前水產(chǎn)品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主要研究方法是SPME-GC-MS技術(shù)[4-8],主要方法是利用SPME萃取樣品中的揮發(fā)性物質(zhì),然后GC-MS進(jìn)行分離和鑒定。近年來(lái)一些學(xué)者對(duì)各種腌魚(yú)的風(fēng)味進(jìn)行研究[9-11],但是關(guān)于發(fā)酵魚(yú)肉的風(fēng)味研究很少,如李春萍[12]研究臭鱖魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中的風(fēng)味物質(zhì),發(fā)現(xiàn)醇類(lèi)含量最高,而丁酸、三甲胺和芳樟醇對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較大,管娟[13]研究固態(tài)發(fā)酵鰳魚(yú),發(fā)現(xiàn)接種清酒乳桿菌發(fā)酵時(shí)揮發(fā)性羰基類(lèi)以及醇類(lèi)、酸類(lèi)化合物的種類(lèi)和含量明顯增加。本實(shí)驗(yàn)以鱘魚(yú)為原料,采用傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝,利用SPME-GC-MS方法分析從原料到發(fā)酵成熟過(guò)程中鱘魚(yú)肉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)和含量的變化,探討發(fā)酵鱘魚(yú)風(fēng)味形成的過(guò)程,旨在研究整個(gè)發(fā)酵過(guò)程鱘魚(yú)的風(fēng)味品質(zhì),以期為鱘魚(yú)的綜合加工利用提供參考依據(jù)。
鱘魚(yú)由惠眾漁業(yè)有限公司惠水養(yǎng)殖基地提供。
氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸鹽(均為分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品 德國(guó)CNW科技公司。
SPME裝置:手動(dòng)進(jìn)樣手柄、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙基(polydimethylsiloxane/divinylbenzene,PDMS/DVB)萃取頭 美國(guó)Supelco公司;GC6890-MS5975 GC-MS儀、HP-5MS彈性毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm) 美國(guó)Agilent公司。
1.3.1 樣品處理
工藝流程:新鮮鱘魚(yú)→取肉→腌制→發(fā)酵→成品。
操作要點(diǎn):取鮮活的鱘魚(yú)宰殺,去頭、尾、內(nèi)臟,取肉瀝干,魚(yú)片切成每塊質(zhì)量20~30 g,添加魚(yú)塊質(zhì)量3%食鹽和各種香辛料(辣椒、花椒、姜等),攪拌均勻,在4 ℃腌制2 d,然后在50~60 ℃干燥3 h,干燥至水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)約55%~60%,冷卻至室溫,在容器的底部鋪上部分糯米粉,然后魚(yú)與糯米粉交替平鋪,壓緊,頂部鋪上一層糯米粉后夯實(shí),加蓋,封嚴(yán),20~24 ℃發(fā)酵5~6 周,直至pH 4.1~4.4制得即食休閑風(fēng)味發(fā)酵魚(yú)制品。
樣品采集:選擇新鮮、腌制、發(fā)酵5、10、20、25、35 d的鱘魚(yú)發(fā)酵樣品(編號(hào)分別為CX、CTA、CTB、TCC、CTD、CTE、CTF),每個(gè)時(shí)期取3 個(gè)平行作為重復(fù),其中發(fā)酵階段取3 個(gè)不同位置作為3 個(gè)樣品。
1.3.2 SPME-GC-MS檢測(cè)
研究報(bào)道萃取時(shí)添加飽和NaCl溶液可以有效終止魚(yú)肉酶活性,降低揮發(fā)性風(fēng)味成分的溶解度,促進(jìn)揮發(fā)性化合物的揮發(fā),從而提高萃取效率[14]。將各組樣品分別與0.18 g/mL的NaCl溶液按1∶1質(zhì)量比混合,勻漿后稱(chēng)取5 g樣品到頂空瓶中待測(cè),平行測(cè)定3 次。
SPME條件:65 μm萃取頭250 ℃老化30 min后,插入樣品瓶中,距頂端4 mm左右,在35、45、60、80、95 ℃水浴溫度吸附40 min,然后插入GC進(jìn)樣口中,250 ℃解吸5 min后,取出萃取頭,GC-MS分析檢測(cè)。
GC條件:HP-5MS彈性毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);不分流模式進(jìn)樣;升溫程序:柱初溫40 ℃,保持2 min,以4 ℃/min升至160 ℃,而后以10 ℃/min升至250 ℃,保持5 min;進(jìn)樣口溫度250 ℃;載氣(He)流量1.0 mL/min。
MS條件:傳輸線溫度280 ℃;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;電子能量70 eV;質(zhì)量掃描范圍m/z 35~450。
1.3.3 定性與定量分析
定性:利用系統(tǒng)自帶NIST 02和Wiley質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)分析,且僅當(dāng)正反匹配度均大于800(最大值1 000)的化合物才予以報(bào)道[15-16]。具體以C7~C40的正構(gòu)烷烴為標(biāo)準(zhǔn)品,通過(guò)和文獻(xiàn)中的保留指數(shù)比對(duì)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品的保留指數(shù),再結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)的分析,最終對(duì)化合物進(jìn)行定性。
定量:利用面積歸一化法計(jì)算各成分在樣品中揮發(fā)性成分的相對(duì)含量,峰面積積分由安捷倫工作站完成;每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù),結(jié)果作方差分析,利用SPSS 21.0軟件分析處理[17]。
1.3.4 關(guān)鍵風(fēng)味化合物的確定
采用相對(duì)氣味活度值(relative odor activity value,ROAV)法[18],選擇樣品中總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的組分定義ROAVstan=100,其他揮發(fā)性物質(zhì)ROAV則按下式計(jì)算:
式中:Cri為揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量/%;Ti為相應(yīng)物質(zhì)感覺(jué)閾值/(μg/L);Crstan為對(duì)總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大組分的相對(duì)含量/%;Tstan為對(duì)應(yīng)物質(zhì)的感覺(jué)閾值/(μg/L)。
利用Xcalibur軟件分析GC-MS數(shù)據(jù);所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel、SPSS 17.0分析處理。
采用SPME-GC-MS對(duì)各發(fā)酵階段鱘魚(yú)樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定,得到不同發(fā)酵階段樣品的GC-MS總離子流圖,見(jiàn)圖1。將取得的色譜峰在NIST譜庫(kù)檢索以及參考文獻(xiàn),確定鱘魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中共鑒定出108 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),其中烴類(lèi)、酯類(lèi)、芳香類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)、酸類(lèi)、酚類(lèi)、醇類(lèi)以及其他類(lèi)分別為17、13、6、11、21、7、1、29 種和3 種。
圖1 不同發(fā)酵階段鱘魚(yú)揮發(fā)性成分總離子流圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatogram of volatile compounds in fermented sturgeon meat sampled at different fermentation stages
由表1可得,不同發(fā)酵階段鱘魚(yú)肉的揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類(lèi)以及相對(duì)含量的變化比較明顯。鮮魚(yú)、腌制、發(fā)酵5、10、20、25 d和35 d 7個(gè)階段的揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類(lèi)分別為38、48、66、72、75、76 種和84 種;隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)由前期的38 種增至成熟時(shí)的84 種,酯類(lèi)、酸類(lèi)和酚類(lèi)的相對(duì)含量增加最為明顯,由前期的未檢出到發(fā)酵成熟時(shí)相對(duì)含量已達(dá)到19.63%。發(fā)酵成熟時(shí),醛類(lèi)、醇類(lèi)、烴類(lèi)及酮類(lèi)是發(fā)酵鱘魚(yú)的主要揮發(fā)性成分,說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程中這些物質(zhì)的變化反應(yīng)鱘魚(yú)發(fā)酵風(fēng)味的形成過(guò)程。
2.2.1 醇類(lèi)化合物
在鱘魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中醇類(lèi)化合物的種類(lèi)由新鮮時(shí)的12 種增加至發(fā)酵成熟時(shí)的26 種,但是醇類(lèi)化合物的相對(duì)含量逐漸降低。在新鮮魚(yú)肉中的主要醇類(lèi)物質(zhì)是2-辛炔醇和1-辛烯-3-醇,但在腌制后相對(duì)含量明顯下降且隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)相對(duì)含量越來(lái)越低;腌制后的主要醇類(lèi)物質(zhì)是1-戊烯-3-醇和桉油醇,其中相對(duì)含量也是隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低,但是桉油醇在新鮮魚(yú)肉中未 檢測(cè)出。己醇在發(fā)酵初期的相對(duì)含量最高,隨后逐漸降低,到發(fā)酵成熟時(shí)相對(duì)含量比在新鮮和腌制2個(gè)階段的相對(duì)含量都高。相對(duì)含量較高的桉油醇和芳樟醇僅發(fā)酵鱘魚(yú)中產(chǎn)生,主要原因是這2種物質(zhì)不是水產(chǎn)品本身所含物質(zhì),而是添加香辛料進(jìn)入魚(yú)體的,成為加工類(lèi)魚(yú)制品的新風(fēng)味成分[12]。同樣雪松醇和松油醇也有可能是通過(guò)添加劑進(jìn)入魚(yú)體,成為發(fā)酵鱘魚(yú)的特有風(fēng)味物質(zhì)。2-丁醇僅在發(fā)酵成熟后檢測(cè)出。其中飽和醇類(lèi)的閾值高,所以對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)就小[19]。不飽和醇閾值低,有特殊的香氣[20],對(duì)魚(yú)類(lèi)風(fēng)味的貢獻(xiàn)大。1-辛烯-3-醇在水產(chǎn)品中非常常見(jiàn),本實(shí)驗(yàn)中此物質(zhì)在新鮮魚(yú)肉中的相對(duì)含量最大,但隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),相對(duì)含量明顯下降,它是亞油酸的氫過(guò)氧化物降解產(chǎn)物[21],可產(chǎn)生蘑菇風(fēng)味[22],普遍存在于淡水魚(yú)及海水魚(yú)的揮發(fā)性物質(zhì)中[23],因其閾值低,故對(duì)鱘魚(yú)的風(fēng)味形成貢獻(xiàn)很大。
2.2.2 烴類(lèi)化合物
在鱘魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中檢出的烴類(lèi)化合物共17 種,各個(gè)階段均檢測(cè)到大量烴類(lèi)化合物,相對(duì)含量較高,但飽和烴化合物閾值一般都很高,所以對(duì)鱘魚(yú)發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味貢獻(xiàn)較小。2,6,10,14-四甲基十五烷能夠賦予食品清香和甜香[24]。十四烷、十五烷、十六烷、十七烷和十七烷可能是由高分子質(zhì)量的非不飽和脂肪酸降解產(chǎn)生,發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)含量逐漸降低可能是被進(jìn)一步分解為小分子化合物。研究發(fā)現(xiàn),C6~C19存在于魚(yú)類(lèi)和甲殼動(dòng)物類(lèi)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中,但因其閾值高,對(duì)水產(chǎn)品的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)不大[25]。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中檢測(cè)到多種萜烯類(lèi)化合物,其在其他水產(chǎn)研究中也有相關(guān)報(bào)道[26-28]檢測(cè)到。在一定條件下,烴類(lèi)化合物可形成醛、酮和醇類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)[29],所以對(duì)鱘魚(yú)風(fēng)味的形成具有潛在作用。
2.2.3 酯類(lèi)化合物
酸和醇可發(fā)生酯化反應(yīng)形成酯類(lèi)化合物[30]。在整個(gè)鱘魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中,新鮮鱘魚(yú)和腌制階段未檢測(cè)到酯類(lèi)物質(zhì),發(fā)酵成熟后累積了大量的酯類(lèi)物質(zhì),酯類(lèi)物質(zhì)可賦予食品水果香味[31-32],是促進(jìn)鱘魚(yú)發(fā)酵風(fēng)味形成的重要物質(zhì)。在發(fā)酵成熟時(shí),乙酸乙酯相對(duì)含量在酯類(lèi)物質(zhì)中最高,又因其閾值低,故對(duì)鱘魚(yú)發(fā)酵樣品的風(fēng)味貢獻(xiàn)率較大,使得發(fā)酵鱘魚(yú)具有特殊的酯香味。
2.2.4 醛類(lèi)化合物
醛類(lèi)化合物主要是酶和微生物氧化脂類(lèi)化合物形成的[33],閾值低,因氣味加和作用,即使微量也會(huì)對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味產(chǎn)生很大影響[34],因此被認(rèn)為是腌臘魚(yú)的主要特征風(fēng)味物質(zhì)。鱘魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中共檢測(cè)到21 種醛類(lèi)物質(zhì),隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)醛類(lèi)化合物的種類(lèi)增多。己醛濃度高時(shí)產(chǎn)生酸敗味,濃度低時(shí)則產(chǎn)生清香味和香草味[35],是亞油酸的氧化產(chǎn)物[36],在鱘魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中其相對(duì)含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低,使得發(fā)酵成熟產(chǎn)品產(chǎn)生更好的香味。壬醛有柑橘的香味[37],閾值低,在發(fā)酵過(guò)程中均檢測(cè)到壬醛的存在,是發(fā)酵鱘魚(yú)的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)。2,4-庚二烯醛是魚(yú)類(lèi)的腥味物質(zhì)[11],是生魚(yú)肉的特征揮發(fā)物質(zhì),隨著發(fā)酵的延長(zhǎng)其相對(duì)含量逐漸降低,使得發(fā)酵鱘魚(yú)的腥味減弱。2,4-癸二烯醛具有油炸的脂香味,在新鮮和腌制過(guò)的鱘魚(yú)中被檢出[38]。苯甲醛有甜橙氣息[39],在發(fā)酵過(guò)程中檢測(cè)到這種物質(zhì),因其閾值低,所以對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)大。十二醛、十三醛、十四醛、十六醛、7-十六烯、9,17-十八碳二烯醛這些分子質(zhì)量大的物質(zhì)只在腌制和發(fā)酵的樣品中被檢出,在新鮮魚(yú)肉中未檢測(cè)到,說(shuō)明這些物質(zhì)對(duì)發(fā)酵鱘魚(yú)的特征風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)。
2.2.5 酮類(lèi)化合物
酮類(lèi)化合物具有特殊的香味,大多數(shù)呈現(xiàn)脂肪味和焦燃味,因其閾值高于其同分異構(gòu)體的醛[40],所以對(duì)魚(yú)肉風(fēng)味的貢獻(xiàn)比醛類(lèi)小。酮類(lèi)化合物可增強(qiáng)魚(yú)肉的腥味,本實(shí)驗(yàn)中新鮮和腌制的鱘魚(yú)酮類(lèi)化合物在揮發(fā)性物質(zhì)中的相對(duì)含量比發(fā)酵各個(gè)階段的相對(duì)含量都高,這就可解釋發(fā)酵成熟的鱘魚(yú)腥味很弱的原因。3,5-辛二烯-2-酮具有動(dòng)物油脂味,普遍存在新鮮的魚(yú)中,所以在發(fā)酵樣品中未檢出。
2.2.6 酸類(lèi)化合物
整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中共檢測(cè)到7 種酸類(lèi)物質(zhì)。這些物質(zhì)在新鮮和腌制后的魚(yú)肉中都未檢測(cè)到,只是在發(fā)酵過(guò)程中或者發(fā)酵結(jié)束才檢測(cè)到。有研究表明[41],酸類(lèi)物質(zhì)一是由細(xì)菌利用氨基酸發(fā)酵形成,二是脂質(zhì)氧化形成。所以本實(shí)驗(yàn)中酸類(lèi)的形成是在微生物的作用下發(fā)酵形成還是魚(yú)肉中脂質(zhì)物質(zhì)氧化形成還不確定,待進(jìn)一步研究。
表1 不同發(fā)酵階段鱘魚(yú)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分的相對(duì)含量Table 1 Relative contents of volatile fl avor compounds in fermented sturgeon sampled at different fermentation times%
續(xù)表1%
續(xù)表1%
表2 不同發(fā)酵階段鱘魚(yú)揮發(fā)性風(fēng)味成分的ROAVTable 2 ROAVs of volatile compounds in fermented sturgeon sampled at different fermentation times
ROAV越大說(shuō)明這種物質(zhì)對(duì)樣品的總體風(fēng)味貢獻(xiàn)也越大。一般認(rèn)為ROAV不小于1的物質(zhì)為樣品的關(guān)鍵風(fēng)味化合物,ROAV大于等于0.1且小于1的組分對(duì)樣品的總體風(fēng)味具有重要影響[42]。如表2所示,1-辛烯-3-醇、壬醛和癸醛是新鮮鱘魚(yú)和整個(gè)鱘魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。苯乙醛和檸檬烯是發(fā)酵開(kāi)始至成熟的關(guān)鍵風(fēng)味化合物。新鮮鱘魚(yú)肉的主體風(fēng)味物質(zhì)為2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、壬醛、癸醛、己醛等;腌制后的鱘魚(yú)肉主體風(fēng)味物質(zhì)為壬醛、1-辛烯-3-醇、己醛、癸醛、檸檬烯等;發(fā)酵5 d鱘魚(yú)肉的主體風(fēng)味物質(zhì)為1-辛烯-3-醇、檸檬烯、壬醛、乙酸乙酯、庚醇等;發(fā)酵10 d鱘魚(yú)肉的主體風(fēng)味物質(zhì)為壬醛、1-辛烯-3-醇、乙酸乙酯、檸檬烯、癸醛等;發(fā)酵20 d鱘魚(yú)肉的主體風(fēng)味物質(zhì)為壬醛、檸檬烯、1-辛烯-3-醇、癸醛、乙酸乙酯等;發(fā)酵25 d鱘魚(yú)肉的主體風(fēng)味物質(zhì)為壬醛、檸檬烯、1-辛烯-3-醇、乙酸乙酯、癸醛等;發(fā)酵35 d鱘魚(yú)肉的主體風(fēng)味物質(zhì)為乙酸乙酯、檸檬烯、壬醛、1-辛烯-3-醇、庚醇等??梢钥闯銮捌诤秃笃诘年P(guān)鍵風(fēng)味大致相同,與中期的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)略有不同,其具體原因有待進(jìn)一步研究。但蔡瑞康等[43]在研究大黃魚(yú)糟制過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)發(fā)現(xiàn)糟制前期關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)是壬醛、辛醛和2,3-戊二酮;中期是乙酸乙酯、辛酸乙酯和苯甲醛;成熟時(shí)為乙酸乙酯和辛酸乙酯。這可能與發(fā)酵時(shí)選擇魚(yú)的種類(lèi)有關(guān)。
采用SPME-GC-MS技術(shù)可更全面、準(zhǔn)確地鑒定鱘魚(yú)整個(gè)發(fā)酵時(shí)期的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),然后采用ROAV法分析發(fā)酵過(guò)程中各樣品的主體風(fēng)味構(gòu)成。結(jié)果表明主要關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)由2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇和壬醛、己醛、乙酸乙酯組成。且前期和后期的關(guān)鍵風(fēng)味大致相同,與中期的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)略有不同。通過(guò)研究鱘魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)和相對(duì)含量變化,可為風(fēng)味的形成機(jī)理及品質(zhì)控制提供參考依據(jù),為提高鱘魚(yú)發(fā)酵的風(fēng)味品質(zhì)提供方向。