關(guān)博元,張正翰,石佳鑫,時(shí) 旭,岳喜慶*,楊 梅*
(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110866)
乳是雌性哺乳動(dòng)物分娩后從乳腺分泌的一種生物流體,含有多種功能性生物活性成分,如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、核苷酸以及蛋白質(zhì)等,在機(jī)體免疫、生長(zhǎng)發(fā)育以及腸道微生物群落調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[1-2]。在母體分娩15 d以后所分泌的乳稱為常乳,常乳分泌時(shí)間長(zhǎng),對(duì)哺乳嬰幼兒十分重要。牛乳含有人體生長(zhǎng)發(fā)育以及維持機(jī)體健康所需的氨基酸、礦物質(zhì)、維生素以及乳蛋白和乳脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),被認(rèn)為是人類的理想天然食品之一[3]。
雖然牛乳的營(yíng)養(yǎng)成分組成與人乳相近而被作為人乳替代品首選,但是牛乳和人乳的物質(zhì)組成上仍然存在質(zhì)與量的差異,人常乳中乳清蛋白與酪蛋白的比例為60∶40,而牛常乳中乳清蛋白與酪蛋白比例為20∶80,雖然牛乳中酪蛋白比重高于人乳,但是實(shí)驗(yàn)證明人乳具有高成分β-酪蛋白和低成分αS1-酪蛋白,較牛乳更為營(yíng)養(yǎng)[4-5]。人常乳中的免疫球蛋白A、乳鐵蛋白和溶菌酶占總蛋白的30%,高于牛常乳,能夠有效抑制嬰幼兒腸道中病原微生物的生長(zhǎng)繁殖[6]。人乳中脂肪含量與牛乳相近,但是人乳中不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)較牛乳更加合理,容易被嬰幼兒消化吸收[7]。研究表明人乳較牛乳含有更高比例的復(fù)合低聚糖,具有免疫調(diào)節(jié)以及促進(jìn)嬰幼兒結(jié)腸成熟的功能[8-9]。母乳可為新生兒健康提供營(yíng)養(yǎng)、補(bǔ)充腸道益生菌,但是存在無(wú)法母乳喂養(yǎng)的情況,所以有必要開發(fā)一種嬰幼兒配方乳品,以最佳的方式模擬人乳。雖然牛初乳中營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高且富含免疫因子,但是物理性質(zhì)不如牛常乳穩(wěn)定,不適合用于嬰幼兒配方乳品的生產(chǎn)加工,因此通過對(duì)比牛常乳與人常乳的生物活性物質(zhì),開發(fā)更適宜嬰幼兒食用的配方乳品具有重要意義[10-11]。
由于人體攝取乳中蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)取決于其中所含有的各氨基酸之間的比例情況,各氨基酸比例是否合理是嬰幼兒能否獲取營(yíng)養(yǎng)的關(guān)鍵指標(biāo),因此人體對(duì)蛋白質(zhì)的需求實(shí)際上就是對(duì)氨基酸的需要[12-13]。部分學(xué)者在人乳或牛乳中只檢測(cè)到部分氨基酸[14-17],并且也僅對(duì)牛乳和人 乳之間部分氨基酸 進(jìn)行對(duì)比研究[18-19],Liang Xiaona等[20]對(duì)人初乳和牛初乳中全譜游離氨基酸和水解氨基酸的種類及含量進(jìn)行對(duì)比分析,研究發(fā)現(xiàn)雖然牛初乳中水解氨基酸總量高于人初乳,但是人初乳中游離氨基酸總量高于牛初乳且種類更齊全,該實(shí)驗(yàn)僅對(duì)人乳和牛乳的初乳階段進(jìn)行全譜游離氨基酸和水解氨基酸的種類及含量對(duì)比分析。因此為繼續(xù)完善不同泌乳時(shí)期人乳和牛乳中氨基酸的組成與含量差異研究,本實(shí)驗(yàn)以人常乳和牛常乳為原料,對(duì)42 種全譜氨基酸進(jìn)行分析,采用實(shí)驗(yàn)自動(dòng)化程度、靈敏度更高的同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLCMS/MS)技術(shù)[21],測(cè)定乳中全譜游離氨基酸和全譜水解氨基酸,對(duì)人常乳和牛常乳之間的氨基酸組成含量進(jìn)行對(duì)比研究,為配方乳品以及功能性食品的研究提供參考依據(jù)。
人常乳:實(shí)驗(yàn)采集自沈陽(yáng)市某醫(yī)院正常分娩、身體狀況良好、頭胎、飲食正常、年齡26~35 歲,產(chǎn)后30~40 d的產(chǎn)婦15 人,上午10點(diǎn)收集乳樣,將其放入已消毒的采樣瓶中,低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行混合(防止個(gè)體差異)。除當(dāng)天用乳樣放入4 ℃冰箱保存外,其余乳樣均置于-80 ℃冰柜冷藏,乳樣由授乳母親自愿提供。
牛常乳:實(shí)驗(yàn)采集自沈陽(yáng)市富強(qiáng)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng),選取年齡1~5 歲,體質(zhì)量在700 kg左右,泌乳日齡30~40 d的健康荷斯坦奶牛15 頭,上午10點(diǎn)收集乳樣,將其放入已消毒的采樣瓶中,低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行混合(防止個(gè)體差異)。除當(dāng)天用乳樣放入4 ℃冰箱保存外,其余乳樣均置于-80 ℃冰柜冷藏。
甲酸、乙腈(均為色譜純) 美國(guó)Fisher公司;iTRAQ?試劑盒(10%磺基水楊溶液(含有400 pmol/μL的正異亮氨酸)、標(biāo)記緩沖液(含有20 pmol/μL的正纈氨酸)) 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。
U3000液相色譜系統(tǒng) 美國(guó)戴安公司;API3200 QTrap質(zhì)譜系統(tǒng) 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。
1.3.1 樣品衍生化處理
移取80 μL乳樣于1 mL離心管中,向離心管中加入100 μL 10%磺基水楊酸溶液(含有400 pmol/μL正異亮氨酸),渦旋振蕩35 s后8 000 r/min離心5 min,吸取20 μL上層液體于另一1 mL離心管中,邊渦旋邊向離心管中加入50 μL標(biāo)記緩沖液(含有20 pmol/μL正纈氨酸),繼續(xù)渦旋15~20 s后8 000 r/min離心4 min。移取20 μL上層液體置于另一1 mL離心管。每個(gè)離心管中分別加入10 μL稀釋的iTRAQ試劑后充分混勻。室溫條件下靜置孵化30 min后加入10 μL羥胺,渦旋振蕩混勻后8 000 r/min離心5 min。加入40 μL內(nèi)標(biāo)物渦旋混勻后,8 000 r/min離心5 min,上樣待測(cè)。
1.3.2 衍生化樣品HPLC-MS/MS檢測(cè)條件
H P L C條件:色譜柱為M S L a b H P-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);進(jìn)樣量3 μL;流動(dòng)相:A為0.1%甲酸溶液,B為乙腈-0.1%甲酸;流速0.8 mL/min;柱溫50 ℃。梯度洗脫見表1。
表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program
MS條件:電子電離源,正離子電離方式;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描;碰撞氣為Medium;電噴霧電壓5 500 V;霧化溫度500 ℃;霧化氣壓力55 psi;輔助氣壓力60 psi;去簇電壓35 V;射入電壓10 V;碰撞能量30 eV;碰撞室射出電壓5 V;氣簾氣壓30 psi。
1.3.3 樣品酸水解處理及檢測(cè)
取5 mL乳樣于水解管中,加入5 mL濃鹽酸混勻后,用氮?dú)獯祾咂績(jī)?nèi)幾秒鐘后迅速密封,置于120 ℃水解23 h左右,然后取出水解液,4 000 r/min離心5 min后取上清液,用50 μL氮?dú)獯蹈珊螅?00 μL去離子水復(fù)溶,溶液待測(cè)。酸水解后樣品衍生化處理同1.3.1節(jié)。酸水解后衍生化樣品HPLC-MS/MS檢測(cè)條件同1.3.2節(jié)。
使用SPSS 17.0程序?qū)z測(cè)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,使用Levene法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性分析。本研究測(cè)定的氨基酸質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)以 ±s表示,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析,根據(jù)P值判斷差異性。
如圖1所示,12 min內(nèi)得到42 種全譜氨基酸和2 種質(zhì)控氨基酸即正異亮氨酸(Nle)和正纈氨酸(Nva)的總離子流圖。2 種質(zhì)控氨基酸為非人體內(nèi)氨基酸,在樣品預(yù)處理步驟中引入400 pmol/μL Nle,Nle回收后濃度為399.7 pmol/μL,通過Nle回收率校準(zhǔn)各氨基酸的檢測(cè)結(jié)果。在衍生化標(biāo)記步驟中引入20 pmol/μL Nva,Nva回收后濃度為15.97 pmol/μL,Nva用于檢測(cè)標(biāo)記反應(yīng)的效率,反應(yīng)效率在80%~120%為合格[22]。圖1中各離子之間分離清晰,且2 種質(zhì)控氨基酸回收率并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明該方法可以檢測(cè)樣品中各氨基酸的含量。
圖1 44 種氨基酸的總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of 44 amino acids
2.2.1 游離必需氨基酸的對(duì)比分析
表2 人常乳與牛常乳中游離必需氨基酸檢測(cè)結(jié)果Table 2 Contents of free essential amino acids in human and bovine miillkkss
由表2可知,人常乳中9 種必需氨基酸質(zhì)量濃度顯著高于牛常乳(P<0.05),人常乳中His質(zhì)量濃度約是牛常乳17 倍,His能夠緩解由于高脂肪飲食引起的肝損傷[23]。人常 乳中的Leu、Met、Phe以及Thr質(zhì)量濃度顯著高于牛常乳(P<0.05),其中Met在人體中缺少可能會(huì)誘導(dǎo)多發(fā)性硬化癥,對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的組蛋白H3以及DNA的甲基化具有潛在影響[24];Phe可用來(lái)合成神經(jīng)遞質(zhì)和激素參與機(jī)體的糖代謝和脂肪代謝[25];Thr與Fe結(jié)合的Thr-Fe螯合物具有緩解和改善缺鐵性貧血的功能[26],通過牛常乳和人常乳中必需氨基酸質(zhì)量濃度的差異,有助于深入了解人乳和牛乳。
2.2.2 游離非必需氨基酸的對(duì)比分析
由表3可知,人常乳中含有11 種非必需氨基酸,而牛常乳中含有7 種非必需氨基酸,人常乳中的非必需氨基酸與牛常乳相比種類更齊全。人常乳中Glu質(zhì)量濃度最高,這與Ping Feng等[14]測(cè)定結(jié)果一致。人常乳與牛常乳間非必需氨基酸質(zhì)量濃度均存在顯著性差異(P<0.05),除Gln外,人常乳中非必需氨基酸質(zhì)量濃度均高于牛常乳。人常乳中Ser質(zhì)量濃度約是牛常乳27 倍,據(jù)研究表明L-PSer在機(jī)體中通過多種生化和分子機(jī)制起到神經(jīng)保護(hù)的作用,具有治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛力[27-28]。牛常乳中均不含有Asn、Asp、Cys以及Pro,Asn具有維持人體內(nèi)細(xì)胞增殖以及蛋白質(zhì)合成的作用[29];Asp能夠促進(jìn)三羧酸循環(huán),同時(shí)也與鳥氨酸循環(huán)密切相關(guān)[30];L-PCys可為人體補(bǔ)充巰基,維持皮膚的代謝[31];L-Pro與抗壞血酸2種物質(zhì)會(huì)影響DNA甲基化、轉(zhuǎn)錄以及能量代謝[32],人常乳較牛常乳所具有的 營(yíng)養(yǎng)特性可能與這4 種非必需氨基酸有關(guān)。
表3 人常乳與牛常乳中游離非必需氨基酸檢測(cè)結(jié)果Table 3 Contents of free non-essential amino acids in human and bovine miillkkss
表4 人常乳與牛常乳中游離非蛋白質(zhì)編碼氨基酸檢測(cè)結(jié)果Table 4 Contents of free non-protein amino acids in human and bovine miillkkss
如表4所示,人常乳與牛常乳均含有15 種非蛋白質(zhì)編碼氨基酸,Cth、Hcy、Car、Hyl、Sar、Asa和Hcit均未在人常乳與牛常乳中檢出,人常乳與牛常乳除GABA和Ans質(zhì)量濃度差異不顯著外(P>0.05),其他氨基酸質(zhì)量濃度均存在顯著性差異(P<0.05)。在人常乳中Tau、Cit、Abu、Ans、1-MHis、3-MHis以及PSer質(zhì)量濃度高于牛常乳,其中1-MHis是參與神經(jīng)之間信號(hào)傳導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)[33],Cit具有調(diào)節(jié)血壓和抗氧化活性[34],因此非蛋白質(zhì)編碼氨基酸可作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑提升功能性乳制品的品質(zhì)。
2.3.1 水解必需氨基酸的對(duì)比分析
表5 人常乳與牛常乳中水解必需氨基酸檢測(cè)結(jié)果Table 5 Contents of hydrolytic essential amino acids in human and bovine miillkkss
從表5可知,人常乳和牛常乳除Trp外,均含有8 種必需氨基酸,且質(zhì)量濃度均存在顯著性差異(P<0.05),同時(shí)牛常乳中8 種必需氨基酸質(zhì)量濃度明顯高于人常乳,在人常乳必需氨基酸中質(zhì)量濃度最高的是Leu,與Ding Ming等[35]測(cè)定結(jié)果一致,Leu能夠激活人體中雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR),激活后的mTOR可調(diào)節(jié)人體細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂并且促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成[36-37],根據(jù)人常乳和牛常乳氨基酸的組成差異,可進(jìn)一步提升以牛乳為基礎(chǔ)的嬰幼兒配方乳品中氨基酸的生物學(xué)效價(jià)。
2.3.2 水解非必需氨基酸的對(duì)比分析
如表6所示,人常乳和牛常乳除Asn外,均含有10 種非必需氨基酸,人常乳與牛常乳中Asp和Cys質(zhì)量濃度差異不顯著(P>0.05),牛常乳中其他8 種非必需氨基酸質(zhì)量濃度顯著高于人常乳(P<0.05)。在人常乳非必需氨基酸中質(zhì)量濃度最高的是Glu,近期研究表明Glu具有調(diào)節(jié)食欲的作用,Glu衍生物能夠預(yù)防代謝紊亂、心血管疾病等[38],通過對(duì)牛常乳的水解可進(jìn)一步挖掘其中潛在的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,為功能性乳制品的研究提供理論依據(jù)。
表6 人常乳與牛常乳中水解非必需氨基酸檢測(cè)結(jié)果Table 6 Contents of hydrolytic non-essential amino acids in human and bovine milks
2.3.3 水解非蛋白質(zhì)編碼氨基酸的對(duì)比分析
表7 人常乳與牛常乳中水解非蛋白質(zhì)編碼氨基酸檢測(cè)結(jié)果Table 7 Contents of hydrolytic non-protein amino acids in human and bovine miillkkss
從表7可知,人常乳和牛常乳均不含有Cth、Hcy、Car、Hyl、Hyp、3-MHis、PEtN、PSer、Asa和Hcit,在人常乳和牛常乳中GABA、Tau、Abu、Ans、β-Ala、β-Aib以及Etn質(zhì)量濃度存在顯著性差異(P<0.05),其中人常乳Tau質(zhì)量濃度顯著高于牛常乳(P<0.05),其余5 種非蛋白質(zhì)編碼氨基酸質(zhì)量濃度無(wú)顯著性差異(P>0.05)。在人常乳非蛋白質(zhì)編碼氨基酸中,Tau是人體各組織中含量最多的氨基酸之一,被稱為是“半必需氨基酸”,具有多效性功能,包括調(diào)節(jié)人體內(nèi)滲透壓、保持細(xì)胞膜穩(wěn)定性、細(xì)胞內(nèi)鈣代謝以及神經(jīng)元活性,有益于嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育[39-40],通過人常乳和牛常乳非蛋白質(zhì)編碼氨基酸質(zhì)量濃度差異,可為嬰兒氨基酸補(bǔ)充的可能策略提供依據(jù)。
本實(shí)驗(yàn)采用iTRAQ與HPLC-MS/MS相結(jié)合的技術(shù)對(duì)人常乳和牛常乳中42 種全譜氨基酸進(jìn)行測(cè)定,并對(duì)人常乳和牛常乳全譜游離氨基酸和水解氨基酸進(jìn)行定性和定量分析,比較人常乳和牛常乳中氨基酸質(zhì)量濃度差異。結(jié)果表明,在全譜游離氨基酸中,人常乳有7 種未被檢出,而牛常乳有11 種未被檢出,人常乳中游離氨基酸總量為0.37 g/L,約是牛常乳(0.16 g/L)的2 倍,可以看出人常乳中含有的氨基酸種類更齊全;在全譜水解氨基酸中,人常乳和牛常乳均有12 種未被檢出,人常乳中水解氨基酸總量為2.5 g/L,牛常乳中水解氨基酸總量為3.3 g/L。在人常乳的游離氨基酸和水解氨基酸中,Glu質(zhì)量濃度最高。將人常乳和牛常乳中全譜游離氨基酸和水解氨基酸測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析,發(fā)現(xiàn)人常乳、牛常乳中水解氨基酸Trp、Gln、Tau等質(zhì)量濃度均低于游離氨基酸,這主要是由于酸水解處理對(duì)氨基酸中吲哚環(huán)有破壞作用,從而造成氨基酸含量的損失;除Trp、Asn和Cys外,牛常乳中水解必需和非必需氨基酸質(zhì)量濃度均高于人常乳,這與游離氨基酸的部分測(cè)定結(jié)果截然相反,由此說明牛常乳中氨基酸主要以蛋白質(zhì)的形式存在。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)人常乳和牛常乳中全譜游離氨基酸和水解氨基酸差異分析,為未來(lái)配方乳制品以及功能性食品的發(fā)展提供研究參考依據(jù)。