基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)定性定量分析黑豆種皮中可溶型和結(jié)合型花青素

頓 倩，彭 瀚，麥琦瑩，鄧澤元，張 兵*

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

功能性植物所具有的大量生理活性物質(zhì)賦予其巨大的潛在健康益處。這些功能性植物化學(xué)成分有萜類、酚類以及其他類的化學(xué)物如類胡蘿卜素和芥子油苷類，它們具有抗氧化、抗炎、抗增殖活性以及保護(hù)中樞神經(jīng)、肝臟和心血管的作用。公認(rèn)的健康膳食模型——地中海膳食模型中多是以富含各類植物化合物尤其是多酚類的食物為主，流行病學(xué)和干預(yù)研究表明這種飲食模式與多種慢性疾病如心血管疾病、二型糖尿病、癌癥和早衰等呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)[1-5]。

植物中酚類物質(zhì)包括花青素主要以3 種形式存在：游離型、酯化型和結(jié)合型。游離型和酯化型酚類統(tǒng)稱為可溶型酚類，大多在植物細(xì)胞液泡中，結(jié)合型酚類則主要與細(xì)胞壁相結(jié)合[6]。黑豆（Glycine max），又名烏豆、冬豆子，是大豆家族中一種重要的豆科植物[7]。相比其他可食用豆類，黑豆具有較高的酚類化合物含量和抗氧化活性[8]，因此受到廣泛的關(guān)注。大量研究將黑豆?jié)撛诘慕】狄嫣帤w因于其中具有抗氧化活性的可溶型酚類化合物[9-10]，而大量存在于黑豆中的結(jié)合型酚類化合物往往被忽視。近幾年研究表明，結(jié)合型酚類化合物具有很高的健康益處，與游離型酚類不同的是，黑豆的結(jié)合型酚類不能被上消化道消化降解，需到達(dá)大腸經(jīng)腸道菌群酶解釋放出來，被吸收進(jìn)入血液后發(fā)揮與游離型酚類相同的清除自由基、降血壓等活性[11-12]。

共價(jià)結(jié)合在植物難溶性分子如纖維素、半纖維素或蛋白質(zhì)上的結(jié)合型酚類物質(zhì)（包括結(jié)合型花青素）[13-14]，必須通過強(qiáng)烈的酸或堿水解方法才能釋放[15-17]。此外，也有一些文獻(xiàn)報(bào)道酶水解釋放結(jié)合酚的方法[18]。目前鮮見相關(guān)研究比較酸水解和堿水解將植物酚類物質(zhì)中的花青素從食物基質(zhì)上分離出來的效果差異，也缺乏對黑豆中結(jié)合型花青素的研究。本課題組已分析鑒定部分黑豆可溶型酚類和結(jié)合型酚類物質(zhì)的成分與含量，在對不含可溶型酚類成分的黑豆殘?jiān)M(jìn)行水解處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)酸水解提取物總酚含量高于其他水解方案。但經(jīng)過超高效液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀技術(shù)精確定量各類黑豆結(jié)合型酚類提取物中的主要28 種酚類成分后發(fā)現(xiàn)，與其他結(jié)合酚提取方案相比，酸水解所得結(jié)合酚提取物在酚酸、黃酮醇、黃烷醇和黃烷酮的總含量差異不大[19]，意味著導(dǎo)致酸水解所得黑豆結(jié)合型總酚含量更高可能并非取決于結(jié)合型酚類，于是將精力轉(zhuǎn)向結(jié)合型花青素。目前，國外已有一些研究者報(bào)道黑豆中可溶型花青素成分，文獻(xiàn)[20-21]共僅鑒定出8 種可溶型花青素糖苷類以及1 種可溶型花青素苷元，但黑豆結(jié)合型花青素的研究缺乏。因此，本研究在探究黑豆種皮中的可溶型花青素同時(shí)，也研究酸水解、堿水解以及酸堿/堿酸交替不同水解方式所獲得的黑豆結(jié)合型花青素成分和含量，采用超高效液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀和高效液相色譜-電噴霧-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀技術(shù)對黑豆不同花青素提取物中的花青素進(jìn)行定性定量分析，徹底研究黑豆可溶型與結(jié)合型花青素的種類和含量的差異，以指導(dǎo)黑豆花青素成分的提取，深入了解黑豆的營養(yǎng)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟黑豆種子，產(chǎn)地安徽滁州；濃鹽酸、甲醇西隴化工股份有限公司；飛燕草素、矢車菊素、矮牽?；ㄋ?、天竺葵素 美國Sigma-Aldrich公司；甲醇（色譜級） 德國默克公司；甲酸（色譜級） 美國ACROS公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ELx800酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；1290超高效液相色譜儀、1260高效液相色譜儀、Eclipse XDB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、6538高分辨四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀、6430三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；TDL-5-A臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；FA2204B電子天平 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；DR-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SHZ-III型循環(huán)水式真空泵 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-A水浴恒溫振蕩器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 可溶型花青素提取物的制備

參考彭瀚等[19]的方法，并做適當(dāng)改進(jìn)。精確稱取1 g黑豆種皮粉末盛于50 mL避光塑料離心管中，加入20 mL 70%甲醇溶液，渦流混勻后在40 kHz、400 W、30 ℃條件下超聲提取30 min，4 200 r/min離心20 min，收集上清液。所余沉淀再加入20 mL 70%甲醇溶液，并重復(fù)上述方法提取5 次直至溶液無色。合并上清液真空濃縮至10 mL，－20 ℃儲存?zhèn)溆谩悠菲叫刑崛? 次，全程避光。

1.3.2 結(jié)合型花青素提取物的制備

1.3.2.1 酸性結(jié)合型花青素提取物和酸堿輪提結(jié)合型花青素提取物的制備

收集1.3.1節(jié)可溶型花青素已提取干凈的固體殘?jiān)?，干燥后?5 mL 2 mol/L HCl溶液于85 ℃水浴水解1 h。4 200 r/min離心10 min，所得上清液用6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 2。由于黑豆中富含蛋白質(zhì)、糖類等大分子營養(yǎng)物[22]，因而在經(jīng)過強(qiáng)酸強(qiáng)堿水解后，其結(jié)合型酚類提取物中摻雜淀粉、蛋白質(zhì)和高濃度的無機(jī)鹽，因此需要對提取物進(jìn)行純化。固相萃取技術(shù)利用固體吸附劑對液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附能力的不同，富集和分離目標(biāo)化合物，洗脫不需要的雜質(zhì)，從而得到較為純凈的目標(biāo)化合物[23]。具體純化步驟如下：SPE柱先用5 mL甲醇激活，然后用去離子水進(jìn)行平衡處理。樣品用去離子水溶解稀釋后上樣（0.5 mL樣品加5.5 mL去離子水），再用2 倍純水沖洗填料，除去已上樣的填料間摻雜的糖類和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。最后加入含有0.5%甲酸的甲醇溶液洗脫填料上吸附的目標(biāo)物避光氮?dú)獯蹈桑吹玫剿嵝越Y(jié)合型花青素提取物。之后所剩的殘?jiān){(diào)節(jié)至中性后用25 mL，2 mol/L的NaOH溶液25 ℃水解4 h，4 200 r/min離心10 min，所得上清液用6 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 2，然后采用固相萃取法純化溶液并氮?dú)獯蹈?，此為酸堿輪提結(jié)合型花青素提取物。所有實(shí)驗(yàn)平行處理3 次，全程避光。

1.3.2.2 堿性結(jié)合型花青素提取物和堿酸輪提結(jié)合型花青素提取物的制備

收集1.3.1節(jié)可溶型花青素已提取干凈的固體殘?jiān)?，將其干燥后? mol/L NaOH溶液25 mL于25 ℃水解4 h。4 200 r/min離心10 min，所得上清液用6 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 2，然后采用固相萃取法純化溶液并氮?dú)獯蹈?，此為堿性結(jié)合型花青素提取物。之后所剩的殘?jiān){(diào)節(jié)至中性后再用25 mL 2 mol/L的HCl溶液于85 ℃水浴水解1 h，4 200 r/min離心10 min，所得上清液用6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 2，然后采用固相萃取法純化溶液并氮?dú)獯蹈桑藶閴A酸輪提結(jié)合型花青素提取物。所有實(shí)驗(yàn)平行處理3 次，全程避光。

1.3.2.3 花青素的水解

在可溶型與結(jié)合型花青素提取物中既有花青素苷元類又有花青素糖苷類，由于花青素糖苷類性質(zhì)不穩(wěn)定，難以得到穩(wěn)定的花青素糖苷類標(biāo)準(zhǔn)品，所以采用花青素苷元類標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行精確定量分析，將所有花青素糖苷類水解成苷元類并統(tǒng)一進(jìn)行定量。

花青素糖苷類化合物水解方法參考Li Hongyan等[24]方法。將提取得到的濃縮提取液加入濃HCl至HCl終濃度為2 mol/L，置于90 ℃水解2 h（酸水解提取物只水解1 h），之后采用Waters OASIS SPE固相萃取小柱純化分離，過濾冷藏備用，全程避光。

1.3.3 超高效液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀分析條件

定性分析參考彭瀚等[19]的儀器條件，并做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，具體實(shí)驗(yàn)條件如下：

液相色譜條件：色譜分離采用UPLC系統(tǒng)（Agilent 1290 infinity series）。使用Agilent Eclipse XDB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相含0.1%的甲酸溶液（A）和甲酸-甲醇（B），梯度洗脫程序?yàn)椋?～10 min，12%～15% B；10～15 min，15%～25% B；1 5～2 5 m i n，2 5%～4 0% B；2 5～3 0 m i n，40%～60% B；30～35 min，60%～12% B。進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為40 ℃，流速為0.30 mL/min。檢測波長為245、280、320 nm和350 nm，色譜峰的吸收波長在400～600 nm范圍內(nèi)。

質(zhì)譜條件：采用四極桿飛行時(shí)間精密質(zhì)譜儀（Agilent 6538），配有電子電離源，采用正離子模式用于精密質(zhì)量測定。全質(zhì)譜數(shù)據(jù)在m/z 50～1 700范圍獲得，最佳質(zhì)譜參數(shù)如下：毛細(xì)管電壓4.0 kV，進(jìn)樣錐電壓35 V，去溶劑化氣流（N2）速率為900 L/h，進(jìn)樣錐氣流（N2）速率為50 L/h，去溶劑溫度為350 ℃，離子源溫度為150 ℃，碰撞誘導(dǎo)解離（collisionally induced dissociation，CID）模式下的碰撞氣體采用高純度的氦氣，進(jìn)氣壓力為40 psi，多酚單體的CID碰撞能為5、10、15、20、25 eV和30 eV，黃酮類的碰撞能為5、10、15、20、25、30、40 eV和50 eV，裂解電壓為175 V。數(shù)據(jù)獲取和加工的質(zhì)譜軟件包括Mass Hunter Acquisition B.03.01、Qualitative Analysis B.03.01。

1.3.4 高效液相色譜-電噴霧-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀分析條件

定量分析參考彭瀚等[19]的液相色譜和質(zhì)譜條件，并做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，具體實(shí)驗(yàn)條件如下：

液相色譜條件：色譜分離采用高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent 1260 infinity series）。使用Agilent Eclipse XDB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相含0.1%的甲酸溶液（A）和甲酸-甲醇溶液（B），梯度洗脫程序?yàn)椋?～5 min，15%～25% B；5～12 min，20%～40% B；12～20 min，40%～60% B；20～25 min，60～15% B。進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為40 ℃，流速為1 mL/min。檢測波長280、320 nm和540 nm，色譜峰的吸收波長在400～600 nm范圍內(nèi)。

質(zhì)譜條件：采用三重四極桿串聯(lián)精密質(zhì)譜儀（Agilent 6430），配有電子電離源，采用負(fù)離子和正離子模式用于精密質(zhì)量測定。全質(zhì)譜數(shù)據(jù)在m/z 50～1 000范圍獲得，最佳質(zhì)譜參數(shù)如下：毛細(xì)管電壓4.0 kV，進(jìn)樣錐電壓35 V，去溶劑化氣流（N2）速率為900 L/h，進(jìn)樣錐氣流（N2）速率為50 L/h，去溶劑溫度為350 ℃，離子源溫度為150 ℃，CID模式下的碰撞氣體采用高純度的氦氣，進(jìn)氣壓力設(shè)置為40 psi，標(biāo)準(zhǔn)品的CID碰撞能為5～35 eV，裂解電壓為135 V。數(shù)據(jù)獲取和加工的質(zhì)譜軟件包括Mass Hunter Acquisition B.03.01、Qualitative Analysis B.03.01。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參考Sun Yong等[25]方法，精密稱取干燥恒質(zhì)量的花青素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用80%甲醇溶液溶解配制成0.195 3～100 μg/mL的外標(biāo)溶液?；ㄇ嗨靥崛∥飿悠方?jīng)純化分離后，稀釋0、2、5 倍，過膜進(jìn)樣，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣3 次，所有定量實(shí)驗(yàn)包括制樣與進(jìn)樣程序在24 h內(nèi)連續(xù)避光完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為 ±s。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，圖像采用Origin繪圖軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

圖1 飛燕草素（a）和天竺葵素（b）的紫外光吸收峰（260～290 nm）和可見光特征吸收峰（500～560 nm）0 nmFig. 1 Ultraviolet (260-290 nm) and visible light (500-560 nm)characteristic absorption peaks of delphinidin (a) and pelargonidin (b)

如圖1所示，在鑒定提取物中花青素時(shí)，花青素在275 nm和530 nm波長左右具有特征吸收峰，且有文獻(xiàn)指出花青素的特征吸收峰在500～600 nm波長范圍內(nèi)[26-27]，而大部分酚類在500 nm波長左右沒有吸收，為區(qū)別提取物中同時(shí)含有的花青素和一般酚類，采用400～600 nm波長的可見光波段作為掃描波長，根據(jù)花青素基本結(jié)構(gòu)可知，花青素正離子電離狀態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，因此采用正離子模式電離得到花青素正離子。

2.1 黑豆可溶型和結(jié)合型花青素的組成鑒定結(jié)果

根據(jù)文獻(xiàn)對比各類水解方法可知，黑豆酸水解的結(jié)合型酚類提取效率最高[19,28]。而在本實(shí)驗(yàn)從黑豆中分離純化得到可溶型和結(jié)合型花青素提取物，如圖2、3和表1所示。

圖2 黑豆SAE的總離子流圖（A）和520 nm波長處的色譜圖（B）Fig. 2 Total ion current chromatograms of SAE (A) and chromatogram at 520 nm (B)

圖3 黑豆單次酸水解所得結(jié)合型花青素提取物的總離子流圖（A）和520 nm掃描波長處色譜圖（B）Fig. 3 Total ion current chromatogram (A) of the bound anthocyanin extract from acid hydrolysis of black soybeans and chromatogram at 520 nm (B)

表1 超高效液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用鑒定黑豆可溶型和結(jié)合型花青素的組成Table 1 Identification of soluble and bound anthocyanins in black soybean by UPLC-ESI-QTOF-MS

相比于黑豆結(jié)合型花青素，可溶型花青素種類更為豐富。在黑豆種皮的可溶型和結(jié)合型花青素提取物中，共鑒定出17 種花青素，包括11 種花青素糖苷類以及6 種花青素苷元。

2.1.1 花青素苷元類

從表1可以看出，花青素苷元的保留時(shí)間比花青素糖苷類普遍更長。鑒定出來的6 種花青素苷元分別是飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛花素、天竺葵素、芍藥花素和芹菜定。其中，化合物12的保留時(shí)間17.062 min，特征吸收波長535 nm，如圖4A所示，被鑒定為飛燕草素[29]?；衔?3（保留時(shí)間17.602 min，最大吸收波長523 nm，m/z287.055 1）被鑒定為矢車菊素（圖4B）[29]?；衔?4（保留時(shí)間19.999 min，最大吸收波長540 nm，m/z317.063 7）被鑒定為矮牽?；ㄋ兀▓D4C）[29]?；衔?6（保留時(shí)間23.672 min，最大吸收波長517 nm，m/z271.059 0），如圖4D所示，被鑒定為天竺葵素[30]?；衔?5和17保留時(shí)間分別為20.704 min和29.503 min，特征吸收波長為518 nm和522 nm，被初步鑒定為芍藥花素和芹菜定[29,31]。

圖4 黑豆花青素離子碎片圖譜：飛燕草素（A）、矢車菊素（B）、矮牽?；ㄋ兀–）、天竺葵素（D）、飛燕草素--33--O-葡糖苷（E）、矢車菊素--33--O-葡糖苷（FF）Fig. 4 Mass fragmentograms of black soybean anthocyanins:delphinidin (A), cyanidin (B), petunidin (C), pelargonidin (D),delphinidin-3-O-glucoside (E), and cyanidin-3-O-glucoside (F)

2.1.2 花青素糖苷類

共鑒定出11 種花青素糖苷類，分別為飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-半乳糖苷、矮牽?；ㄋ?3-O-葡萄糖苷、矮牽?；ㄋ?3-O-半乳糖苷、天竺葵素-3-O-蕓香糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、天竺葵素-3-O-己糖苷、芍藥花素-3-O-己糖苷、天竺葵素-3-O-(6”-丙二酰葡萄糖苷)和芹菜定-3-O-(6”-丙二酰葡萄糖苷)。其中，化合物1被鑒定為天竺葵素-3-O-蕓香糖苷[32]?；衔?和化合物3分子離子峰為465 [C21H21O12]+，碎片離子峰為飛燕草素苷元離子303 [M－C6H10O5]+，由于飛燕草素-3-O-半乳糖苷極性大于飛燕草素-3-葡萄糖苷，因此化合物3被鑒定為飛燕草素-3-O-葡萄糖苷，而化合物2被鑒定為飛燕草素-3-半乳糖苷（圖4E）[33]?；衔?經(jīng)過電離碰撞產(chǎn)生了矮牽牛花素苷元離子317.064 6 [M－C6H10O5]+，被鑒定為矮牽牛花素-3-O-半乳糖苷[28,33]，而化合物7具有較長的保留時(shí)間和同樣的矮牽牛花素苷元離，被鑒定為矮牽牛花素-3-O-葡萄糖苷。化合物4被鑒定為矢車菊素-3-O-半乳糖苷，而相似的，化合物6被鑒定為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（圖4F）[24,29]。同理，化合物8產(chǎn)生芍藥花素苷元離子301.069 9 [M－C6H10O5]+，而化合物9產(chǎn)生天竺葵素苷元離子峰271.059 3 [M－C6H10O5]+，被分別鑒定為芍藥花素-3-O-己糖苷和天竺葵素-3-O-己糖苷[25,33]。根據(jù)離子碎片天竺葵素271.059 9 [M－C9H11O8]+和芹菜定255.064 0 [M－C9H11O8]+，化合物10和化合物11被鑒定為天竺葵素-3-O-(6”-丙二酰葡萄糖苷)和芹菜定-3-O-(6”-丙二酰葡萄糖苷)[24]。

2.1.3 黑豆可溶型和結(jié)合型花青素的提取結(jié)果

如圖5、表2所示，在可溶型花青素提取物中，花青素主要以糖苷類形式存在，11 種花青素糖苷類化合物均可以檢測得到，但僅含有極少量的苷元（矢車菊素苷元），而在結(jié)合型花青素提取物中，花青素苷元是最主要的花青素成分，在不同水解方法得到的4 種結(jié)合型花青素提取物組分里，酸性結(jié)合型花青素提取物中能檢測到所有6 種花青素苷元以及4 種花青素糖苷類化合物包括飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷和矮牽?；ㄋ?3-O-葡萄糖苷。而堿性結(jié)合型花青素提取物中僅能檢測到2 種花青素苷元：矢車菊素和矮牽?；ㄋ?，以及1 種花青素糖苷類化合物：矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。此外，在酸堿輪提結(jié)合型花青素提取物中僅有矢車菊素一種花青素苷元，而堿酸輪提結(jié)合型花青素提取物中能得到所有的花青素苷元：矢車菊素和矮牽?；ㄋ?，且所有的糖苷類花青素在這2個(gè)組分中均無法檢測到。

圖5 黑豆中花青素苷元的基本結(jié)構(gòu)Fig. 5 Basic structure of anthocyanin aglycone in black soybean

表2 黑豆中花青素苷元對應(yīng)結(jié)構(gòu)Table 2 Corresponding structures of anthocyanin aglycones in black soybean

2.2 黑豆可溶型和結(jié)合型花青素含量測定結(jié)果

2.2.1 花青素定量條件的優(yōu)化結(jié)果

表3 花青素標(biāo)品正離子模式下的定量條件Table 3 Quantitative conditions under positive ion mode for anthocyanin standards

如表3所示，不同花青素標(biāo)準(zhǔn)品的定量，所需質(zhì)譜條件不同。選取樣品中4 種主要的花青素，設(shè)計(jì)最優(yōu)洗脫程序并選取最合適的碎片離子，優(yōu)化碰撞能和裂解電壓。

2.2.2 黑豆可溶型和結(jié)合型花青素的定量結(jié)果

利用優(yōu)化條件對黑豆可溶型和結(jié)合型花青素提取物中4 種最主要的花青素苷元當(dāng)量進(jìn)行定量。如表4所示，在可溶型花青素提取物中，矢車菊素（438.43 μg/g，干質(zhì)量計(jì)，下同），飛燕草素（152.35 μg/g）和矮牽牛花素（83.79 μg/g）是黑豆中最為主要的花青素成分，而天竺葵素相對較少，為1.36 μg/g。在結(jié)合型花青素提取物中，對比各組分結(jié)合型花青素含量發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過堿處理后，花青素幾乎不能被水解溶出，如堿性結(jié)合型花青素提取物中僅檢測到0.15 μg/g的矢車菊素，而酸堿輪提結(jié)合型花青素提取物中同樣僅僅檢測到0.62 μg/g的矢車菊素。但在經(jīng)過酸處理后的花青素提取物卻擁有比可溶型花青素總含量更高的花青素苷元，說明酸水解可以有效提取黑豆種皮殘?jiān)械慕Y(jié)合型花青素，這一點(diǎn)尤其反映在矢車菊素的含量上。在經(jīng)過酸水解處理后得到的結(jié)合型花青素提取物中，矢車菊素相對含量極高（＞95%）。在酸性結(jié)合型花青素提取物中，矢車菊素含量約為1 026.71 μg/g，飛燕草素、矮牽牛花素和天竺葵素含量分別為22.67、3.97 μg/g和2.44 μg/g。在堿酸輪提結(jié)合型花青素提取物中，矢車菊素含量約為115.62 μg/g，而剩余的飛燕草素、矮牽?；ㄋ睾吞祗每睾糠謩e為2.39、0.82 μg/g和0.39 μg/g。同時(shí)，除矢車菊素外，酸性結(jié)合型花青素提取物中的矮牽?；ㄋ睾恳诧@著高于可溶型花青素提取物，證明黑豆種皮中含有大量的結(jié)合型花青素，并且酸處理對結(jié)合型花青素有良好的溶出作用，酸水解能將原本穩(wěn)定結(jié)合在植物細(xì)胞壁纖維素和半纖維素大分子上的花青素小分子水解下來，并溶于溶劑中。黑豆中4 種主要的花青素苷元，矢車菊素?zé)o論作為可溶型花青素還是結(jié)合型花青素，都是提取物中最主要的花青素成分。同時(shí)相比在可溶型花青素提取物中，矢車菊素和矮牽牛花素在酸性結(jié)合型花青素提取物和堿酸輪提結(jié)合型花青素提取物中有更高的含量，說明花青素類化合物是結(jié)合型酚類物質(zhì)中極為重要的一類成分，而結(jié)合型花青素作為高效抗氧化活性物質(zhì)，可能是結(jié)合型酚類物質(zhì)中主要功能活性成分?？梢姡Y(jié)合型花青素的鑒定和構(gòu)效關(guān)系的研究對未來植物性功能食品中結(jié)合型酚類物質(zhì)的鑒定和功能研究意義重大。

表4 黑豆種皮中可溶型和結(jié)合型花青素的含量（以干質(zhì)量計(jì)）Table 4 Soluble and bound anthocyanin contents in black soybean seed coat (on a dry mass basis)μg/g

3 結(jié)論與討論

黑豆作為一種藥食兩用植物，具有廣泛的市場前景和開發(fā)利用價(jià)值。花青素是黑豆中的功能性成分之一，具有極強(qiáng)的抗氧化、抗炎、抗腫瘤和心血管以及神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)能力，具有重要健康價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助有機(jī)溶劑提取法獲得黑豆可溶型花青素提取物，并得到不含可溶型花青素的黑豆種皮殘?jiān)?，再進(jìn)一步使用酸水解和堿水解以及酸堿/堿酸輪提的強(qiáng)烈水解方法，獲得黑豆結(jié)合型花青素提取物。采用超高效液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀技術(shù)分析鑒定各類黑豆種皮提取物中所含有的共17 種花青素成分，包括11 種花青素糖苷類化合物：飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-半乳糖苷、矮牽?；ㄋ?3-O-己糖苷、矮牽牛花素-3-O-半乳糖苷、天竺葵素-3-O-蕓香糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、天竺葵素-3-O-己糖苷、芍藥花素-3-O-己糖苷、天竺葵素-3-O-(6”-丙二酰葡萄糖苷)和芹菜定-3-O-(6”-丙二酰葡萄糖苷)；6 種花青素苷元：飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛花素、天竺葵素、芹菜定和芍藥花素，并采用高效液相色譜-電噴霧-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀技術(shù)精確定量各類黑豆種皮提取物中的花青素含量，相比起可溶型花青素提取物中的花青素糖苷類成分，結(jié)合型花青素的結(jié)構(gòu)較為簡單，以花青素苷元為主。所有提取物經(jīng)強(qiáng)酸水解后，酸性結(jié)合型花青素提取物中結(jié)合型花青素的總含量最高，甚至高于可溶型花青素提取物，而其余組分更低，這一點(diǎn)尤其體現(xiàn)在矢車菊素苷元上。此外，在黑豆種皮的可溶型花青素提取物中，花青素主要以花青素糖苷類形式存在，苷元含量相對極少，而在結(jié)合型花青素提取物中，則主要以花青素苷元為主，糖苷類化合物相對少見。

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)和Peng Han等[19]的研究結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，在與結(jié)合型酚類相同的提取條件下所得到的黑豆結(jié)合型花青素提取物中，酸性結(jié)合型花青素提取物中具有含量可觀的花青素成分，主要原因?yàn)楫?dāng)結(jié)合型花青素從纖維素或半纖維素等植物大分子上水解下來后，易被強(qiáng)堿性條件破壞或氧化，而在強(qiáng)酸性環(huán)境里保持了穩(wěn)定，這是由花青素陽離子結(jié)構(gòu)決定的。這很可能就是之前研究中黑豆結(jié)合酚的酸水解方案提取效率最高的主要原因。