膜醭畢赤酵母真空干燥制劑對熱環(huán)境耐受力的提高

張鴻雁，王文軍，鄧麗莉,2，姚世響,2，曾凱芳,2,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

膜醭畢赤酵母（Pichia membranifaciens）為廣譜抗菌性拮抗酵母，可控制不同果實的采后病害[1-2]。而目前膜醭畢赤酵母控制采后病害多采用新鮮的液體制劑，其對控制果蔬采后病害具有顯著的效果，為實現(xiàn)其商業(yè)化應用，制備成易于應用和儲存的干燥制劑是其可行性方法之一[3]。本實驗室通過真空干燥的方法，并添加定量保護劑將膜醭畢赤酵母制備成干燥生防制劑，但在酵母經熱干燥制備活性干酵母過程中諸多因素如高溫、氧化應激等脅迫條件等影響著活性干酵母的最終活性，最終使干酵母制劑的活性大大降低[4]。

在熱干燥過程中酵母細胞需承受熱應力、脫水應力、滲透應力、機械應力等。不同微生物、不同菌株對熱的耐受力不同，酵母細胞細胞壁的主要組分是葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質，整體細胞壁結構較厚[5]，所以對高溫和外界壓力具有較好的耐受性[6]。雖然酵母對外界壓力的耐受力較好，但相關研究表明高溫仍會使其大分子物質如蛋白質、核酸的高級結構遭到破壞；脫水應力也會通過改變細胞質膜的流動性或物理狀態(tài)以及引起脂質過氧化而損傷細胞質膜[7]，最終導致細胞內容物外泄[8]。熱干燥過程中酵母同時受多種壓力的影響，造成酵母細胞損傷。在引起酵母細胞損傷的同時，當溫度或滲透壓突然變化時，酵母細胞也會通過調節(jié)自身代謝和基因表達適應新環(huán)境，如酵母細胞應對逆境條件時會產生應激保護性物質，如甘油、熱激蛋白、海藻糖等[9]。因此可在干燥前增強酵母對脅迫環(huán)境的適應性，從而改善細胞對脅迫壓力的耐受性。在干燥前可通過熱處理[10-11]的方法改善菌體對逆境的耐受力，使之在隨后的干燥及貯藏過程中菌體的存活率更高；或使用過氧化氫增加酵母的抗氧化應激能力[12]。短暫的暴露于一個非致死逆境條件下，可誘導酵母對更極端環(huán)境產生耐受力；另外在培養(yǎng)基中加入酵母不可利用的組分如氯化鈉[13-14]可誘導細胞的滲透壓休克反應；添加外源氯化鈣也可以提高酵母細胞對熱的耐受力[15]。

雖然壓力預處理已被報道可誘導微生物的各種非生物脅迫的交叉保護，但通過壓力預處理提高膜醭畢赤酵母對熱環(huán)境耐受力，并提高真空干燥后活性的相關內容鮮見報道，因此本研究通過在真空干燥前對酵母進行熱處理或過氧化氫處理，在酵母培養(yǎng)基中添加氯化鈉、氯化鈣等方法提高酵母對外界環(huán)境的耐受力，對于制備高活性、高效率的生防干酵母制劑是很必要的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膜醭畢赤酵母（Pichia membranifaciens CICC 32259）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏理中心。該菌株在NYDA培養(yǎng)基（酵母膏5 g、牛肉浸膏8 g、葡萄糖10 g、瓊脂20 g、水1 000 mL）、4 ℃條件下保藏。每2 個月活化1 次。

1 mg/mL 海藻糖標準溶液：準確稱取0.100 g海藻糖，加水溶解，定容至100 mL；蒽酮溶液：準確稱取0.080 g蒽酮溶于50 mL體積分數(shù)76.4%硫酸溶液；0.5 mol/L三氯乙酸溶液：稱取40.847 g三氯乙酸，加水溶解，稀釋至500 mL。

葡萄糖、瓊脂粉、酵母 浸膏、牛肉膏、谷氨酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、過氧化氫、氯化鈉、氯化鈣 成都科龍化工試劑廠；海藻糖美國Sigma公司；脫脂奶粉 杜爾伯特伊利乳業(yè)有限責任公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇凈集團安泰有限公司；B203生物顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司；BS-4G振蕩培養(yǎng)箱 金壇市富華儀器有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱、DZF-6000真空干燥箱、HWS-28數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海齊欣科學儀器有限公司；PSX-280手提式高壓殺菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；XB.K.25血球計數(shù)板型 上海求精生化試劑有限公司；GL-20G-II高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；SL602N高精顯電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；DDS-307A電導率儀 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母懸浮液的制備

膜醭畢赤酵母接種到NYDA培養(yǎng)基上，28 ℃活化48 h，再將活化好的酵母接種到NYDB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，之后1 351×g、4 ℃離心10 min，棄上清液，加入無菌水，再次離心，加入無菌水，血細胞計數(shù)板計數(shù)，最后制成109CFU/mL的酵母懸浮液。

1.3.2 保護劑懸浮液制備

20%海藻糖、2%谷氨酸鈉、5% PVP與20%脫脂奶粉，用無菌水配成保護劑混合液，最后與酵母懸浮液1∶1混合后使混合液中保護劑濃度達到所要求濃度。

1.3.3 不同預處理

1.3.3.1 熱處理溫度及時間篩選

取10 mL酵母懸浮液于離心管中，將其分別置于37、40、43 ℃水浴加熱，并分別在20、30、40 min時取樣并測定處理前后活菌數(shù)[10]。實驗重復3 次。

1.3.3.2 過氧化氫處理濃度及時間篩選

取2 mL酵母懸浮液于10 mL離心管，加入2 mL過氧化氫溶液使混合液中過氧化氫濃度分別為0、1、3、5、10、50、100 mmol/L，置于28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，然后分別在20、40、60 min時取樣，離心去上清液并洗滌2 次保證脫除過氧化氫，加水至原體積并稀釋涂布，測定處理前后酵母活菌數(shù)[12]。實驗重復3 次。

1.3.3.3 培養(yǎng)基中添加氯化鈉、氯化鈣對酵母活性的影響

NYDB培養(yǎng)基分別添加0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mol/L氯化鈉[14]，0、1、5、10 mmol/L氯化鈣[15]，培養(yǎng)24 h后，先取各發(fā)酵液測定酵母細胞初始活菌數(shù)，再將添加不同濃度氯化鈉的發(fā)酵液離心收集菌體，之后分別用無菌水懸浮到109CFU/mL。

1.3.4 酵母的真空干燥

干燥前預處理：1）對酵母懸浮液進行40 ℃、40 min熱處理（HT），5 mmol/L、40 min過氧化氫處理（H2O2T）；2）酵母懸浮液與保護劑懸浮液等體積混合后進行40 ℃、40 min熱處理（HT（Y&P）），5 mmol/L、40 min過氧化氫處理（H2O2T（Y&P））；3）NYDB培養(yǎng)基添加0～0.9 mol/L氯化鈉、0～10 mmol/L氯化鈣培養(yǎng)后離心收集懸浮液。

保護劑添加：1）不添加保護劑：對照組：未經任何處理酵母懸浮液+等體積無菌水，處理組：經HT/H2O2T/NaCl/CaCl2處理后酵母懸浮液+等體積無菌水；2）添加保護劑：對照組：未進行任何處理的酵母懸浮液+等體積保護劑懸浮液；處理組：經HT/H2O2T/NaCl/CaCl2處理后酵母懸浮液+等體積保護劑；3）酵母懸浮液與保護劑懸浮液等體積混合后進行熱處理（HT（Y&P））、過氧化氫處理（H2O2T（Y&P））。以上樣品在旋渦混合儀中均勻混合1 min，之后在室溫下孵化60 min，在此過程中不斷搖動以確保酵母與保護劑混合均勻。

真空干燥：為避免其他因素對干燥膜醭畢赤酵母存活率的影響，將膜醭畢赤酵母的初始濃度、生長條件、干燥溫度、復水條件等影響因素固定。將混合液樣品（2 mL）加入到40 mm×25 mm稱量皿中，并將樣品置于真空干燥箱中，干燥溫度為40 ℃，真空度為0.07 MPa[6]，當混合物的水分質量分數(shù)約為5%時結束干燥，測定存活率。實驗重復3 次。

1.3.5 酵母活性測定

1.3.5.1 熱處理及過氧化氫處理后酵母存活率測定

酵母存活率用處理前酵母的菌落總數(shù)（N0）以及處理后酵母的菌落總數(shù)（Nf）表示[17]。處理前，將適當稀釋倍數(shù)的酵母涂布在NYDA平板上。處理結束后，將適當稀釋倍數(shù)的酵母涂布在NYDA平板上；之后將平板置于28 ℃培養(yǎng)48 h。實驗重復3 次，用下式計算存活率：

1.3.5.2 添加氯化鈉、氯化鈣培養(yǎng)后酵母活菌數(shù)測定

將添加不同物質培養(yǎng)后酵母適當稀釋倍數(shù)的酵母涂布在NYDA平板上，將平板置于28 ℃培養(yǎng)48 h之后取出計數(shù)。

1.3.5.3 經不同預處理酵母真空干燥前后活性測定

稀釋涂布法測定存活率見1.3.5.1節(jié)。

電導率的測定：1）將真空干燥前經不同預處理的酵母與保護劑的混合液；2）經不同預處理、真空干燥后復水的混合液振蕩并充分混合，使用電導率儀測定以上樣品的電導率[18-19]。測定結果表示為真空干燥前后電導率之差。實驗重復3 次。

1.3.6 不同處理后酵母海藻糖含量測定

經熱處理、過氧化氫處理、培養(yǎng)基添加氯化鈉處理、培養(yǎng)基添加氯化鈣處理后，將酵母懸浮液離心并洗滌后收集菌體待用。

1.3.6.1 酵母細胞中海藻糖的提取

取經不同處理后的酵母菌泥250 mg（濕質量）重懸浮于2 mL無菌水，并加入等質量的酸洗玻璃珠（0.5 mm），0 ℃超聲15 min，再煮沸15 min；12 000 r/min離心20 min，取上清液測定海藻糖[20]。

1.3.6.2 蒽酮比色法測定海藻糖

海藻糖標準曲線的繪制參考駱瑩等[21]的方法。

不同處理后酵母胞內海藻糖的測定[20]：在1.3.6.1節(jié)所提上清液中加入4 mL 0.5mol/L三氯乙酸溶液。準確吸取樣液1 mL，分別置于干燥試管中，分別加入5 mL蒽酮溶液，振蕩均勻，在沸水浴中煮沸10 min后立即冷卻到室溫，搖勻后在選定的波長下比色，測定吸光度，以空白作對照。根據(jù)海藻糖標準曲線確定胞內海藻糖的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

運用Excel 2016統(tǒng)計分析不同處理后膜醭畢赤酵母存活率、活菌數(shù)、電導率海藻糖含量等數(shù)據(jù)，以 ±s表示。運用SPSS 17.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）對數(shù)據(jù)進行方差分析，利用Duncan多重比較進行顯著性分析，P值小于0.05，表示差異顯著。運用Graphpad prism 7.0繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 熱處理對膜醭畢赤酵母真空干燥后活性的影響

2.1.1 熱處理溫度及時間

圖1 膜醭畢赤酵母在不同熱處理溫度下的存活率Fig. 1 Survival of heat shock (HS)-treated P. membranifaciens cells

如圖1所示，37 ℃和40 ℃熱處理對酵母存活率基本無影響，43 ℃熱處理時，隨著時間的延長，酵母存活率下降，40 min后下降明顯。因此熱處理溫度不宜超過43 ℃，本研究選擇40 ℃、40 min為酵母熱處理溫度和時間。

2.1.2 熱處理后真空干燥膜醭畢赤酵母活性測定

如圖2A、B所示，經40 ℃熱處理40 min后的酵母在真空干燥后具有更高的存活率，與未經熱處理的對照組有顯著性差異；酵母懸浮液與保護劑的混合液熱處理后進行真空干燥相對于其他處理組具有更高存活率，且差異顯著。如圖2C、D所示，經40 ℃熱處理40 min后干燥前后電導率之間差值比未經熱處理組的差值較小，電導率之間差值越小，說明干燥后酵母細胞死亡越少，存活率相對較高，即經熱處理后酵母細胞死亡減少，活菌數(shù)相對較高；電導率和存活率結果呈一致性；說明在真空干燥前，對膜醭畢赤酵母進行熱處理可以在一定程度上提高熱干燥后酵母的活性。

圖2 熱處理對真空干燥膜醭畢赤酵母存活率（A、B）及電導率（C、D）的影響Fig. 2 Effect of heat shock (HS) on survival (A, B) and extracellular conductivity (C, D) of P. membranifaciens after vacuum drying

2.2 過氧化氫處理對膜醭畢赤酵母真空干燥后存活率的影響

2.2.1 過氧化氫處理濃度及時間

圖3 膜醭畢赤酵母在不同濃度過氧化氫處理下的存活率Fig. 3 Survival of P. membranifaciens cells treated with different concentrations of H2O2

如圖3所示，膜醭畢赤酵母的存活率隨著過氧化氫濃度的增加和處理時間的延長而降低；1～5 mmol/L過氧化氫對酵母處理20～60 min后對其存活率基本沒有影響，10～100 mmol/L過氧化氫對酵母處理20～60 min時，隨著時間的延長，酵母存活率下降明顯；因此本研究選擇5 mmol/L過氧化氫處理40 min酵母提高其干燥后存活率。

2.2.2 過氧化氫處理后真空干燥膜醭畢赤酵母活性測定

圖4 過氧化氫處理對真空干燥膜醭畢赤酵母存活率（A、B）及電導率（C、D）的影響Fig. 4 Effect of H2O2 concentration on survival (A, B) and extracellular conductivity (C, D) of P. membranifaciens after vacuum drying

如圖4A、B所示，經5 mmol/L過氧化氫處理40 min后的酵母在真空干燥后具有更高的存活率，與對照組有顯著性差異；酵母懸浮液與保護劑的混合液經過氧化氫處理后進行真空干燥相對于其他處理組存活率較低，且差異顯著；如圖4C所示，在不添加保護劑時，過氧化氫處理組酵母真空干燥前后電導率之間差值比未經過氧化氫處理組的差值較高，該結果和存活率結果相反。如圖4D所示，在添加保護劑時，未經過氧化氫處理組的酵母真空干燥前后電導率差值最小，其次為過氧化氫處理組，酵母懸浮液與保護劑同時進行過氧化氫處理組差值最大；該結果和存活率結果不相符，一方面可能是過氧化氫處理對電導率有影響，另一方面是酵母和保護劑同時進行過氧化氫處理后洗滌過程中保護劑有部分被洗掉，保護效力降低，酵母死亡數(shù)增加。

2.3 添加氯化鈉處理對膜醭畢赤酵母真空干燥后存活率的影響

2.3.1 培養(yǎng)基中添加氯化鈉對酵母活性的影響

圖5 氯化鈉濃度對膜醭畢赤酵母活菌數(shù)的影響Fig. 5 Effect of different concentrations of sodium chloride on viable count of P. membranifaciens

如圖5所示，隨著氯化鈉濃度的增大，酵母活菌數(shù)下降。經顯著性分析顯示，添加0.3～0.9 mol/L氯化鈉后其活菌數(shù)均顯著低于對照組，說明該濃度氯化鈉抑制酵母生長。

2.3.2 培養(yǎng)基中添加氯化鈉后真空干燥膜醭畢赤酵母活性測定

圖6 氯化鈉濃度對真空干燥膜醭畢赤酵母存活率（A、C）及電導率（B、D）的影響Fig. 6 Effect of different concentrations of sodium chloride on survival(A, C) and extracellular conductivity (B, D) of P. membranifaciens after vacuum drying

如圖6A所示，不添加保護劑時對酵母經真空干燥，培養(yǎng)基中添加0.7～0.9 mol/L氯化鈉處理組的存活率比對照組高，且具有顯著性差異；如圖6B所示，不添加保護劑時酵母干燥前后電導率差值從小到大依次為：0.9 mol/L氯化鈉處理組＜0.7 mol/L氯化鈉處理組＜0.5 mol/L氯化鈉處理組＜0.3 mol/L氯化鈉處理組＜0.1 mol/L氯化鈉處理組＜對照組，且各組之間均具有顯著性差異；該結果和存活率結果基本一致，說明在不添加保護劑進行真空干燥時，培養(yǎng)基中添加0.7～0.9 mol/L氯化鈉可提高熱干燥后酵母的活性。

如圖6C所示，在添加保護劑時對酵母真空干燥，添加0.1～0.7 mol/L氯化鈉處理組的存活率與對照組的存活率無顯著性差異；添加0.9 mol/L氯化鈉處理組的存活率顯著低于對照組。如圖6D所示，添加保護劑時，培養(yǎng)基中添加0.7 mol/L氯化鈉處理組的酵母其干燥前后電導率之差最小，相對于對照組和添加0.1～0.3 mol/L氯化鈉處理組有顯著性差異。

2.4 添加氯化鈣處理對膜醭畢赤酵母真空干燥后存活率的影響

2.4.1 培養(yǎng)基中添加氯化鈣對酵母活性的影響

圖7 氯化鈣濃度對膜醭畢赤酵母活菌數(shù)的影響Fig. 7 Effect of different concentrations of calcium chloride on viable count of P. membranifaciens

如圖7所示，隨著氯化鈣添加濃度的增加，酵母活菌數(shù)升高，且添加10 mmol/L氯化鈣后酵母活菌數(shù)和對照組活菌數(shù)有顯著性差異。

2.4.2 培養(yǎng)基中添加氯化鈣后真空干燥膜醭畢赤酵母活性測定

圖8 氯化鈣濃度對真空干燥膜醭畢赤酵母存活率（A、C）及電導率（B、D）的影響Fig. 8 Effect of different concentrations of calcium chloride on survival(A, C) and extracellular conductivity (B, D) of P. membranifaciens after vacuum drying

如圖8A所示，在不添加保護劑時添加5 mmol/L氯化鈣處理組真空干燥后酵母存活率顯著高于對照組；如圖8B所示，在不添加保護劑時酵母干燥前后電導率從小到大依次為：10 mmol/L氯化鈣處理組＜5 mmol/L氯化鈣處理組＜1 mmol/L氯化鈣處理組＜對照組，各組之間均具有顯著性差異；該結果和存活率結果有差異，綜合干燥后存活率及干燥前后電導率之差，在不添加保護劑對酵母進行真空干燥時添加5 mmol/L氯化鈣可有效提高酵母活性。

如圖8C所示，在添加保護劑時添加1～10 mmol/L氯化鈣處理組的酵母真空干燥后存活率與未添加氯化鈣的對照組存活率無顯著性差異；如圖8D所示，在添加保護劑時，培養(yǎng)基中添加10 mmol/L氯化鈣處理組的酵母真空干燥前后電導率之差最小，相對于對照組和添加1 mmol/L和5 mmol/L氯化鈣處理組有顯著性差異，除添加10 mmol/L氯化鈣處理組外，該結果和存活率結果基本一致。

2.5 不同預處理后酵母細胞內海藻糖含量變化

圖9 不同處理后膜醭畢赤酵母細胞內海藻糖含量Fig. 9 Trehalose contents of P. membranifaciens cells under different treatments

如圖9A所示，對酵母懸浮液進行熱水浴處理后酵母細胞海藻糖含量升高，與未經熱處理的對照組有顯著性差異。如圖9B所示，經過氧化氫處理后酵母細胞海藻糖含量升高，與未經過氧化氫處理的對照組有顯著性差異。如圖9C所示，添加0.7 mol/L氯化鈉時酵母培養(yǎng)后產生的海藻糖含量最高，之后依次為0.9 mol/L＞0.5 mol/L＞0.3 mol/L＞0.1 mol/L＞對照組，且各組間差異顯著。如圖9D所示，添加5 mmol/L氯化鈣時酵母培養(yǎng)后產生的海藻糖含量最高，之后依次為10 mmol/L＞1 mmol/L＞對照組，且各組間差異顯著。

3 結論與討論

了解酵母自身耐受力對于干燥后活性有重要影響，因而通過不同預處理提高酵母對逆境壓力的耐受性，最終提高干燥后酵母活性是一種較為可行的方法，先前已有研究表明生防酵母預先適應一個較為溫和的壓力環(huán)境后，對后續(xù)致死性脅迫壓力的耐受性會增強[22]。如Cheng Zhe等[11]研究發(fā)現(xiàn)高溫（48 ℃）、氧化應激（70 mmol/L H2O2）和鹽脅迫（3 mol/L NaCl溶液）等會對Rhodotorula mucilaginosa造成氧化損傷，而40 ℃、30 min的熱處理可提高粘紅酵母的脅迫耐受性和生物防治效果；熱處理激活酵母抗氧化系統(tǒng)，從而降低其氧化損傷，因此熱處理是改善生防酵母功效的可行方法；劉嘉等[10]先將拮抗酵母置于40 ℃熱水浴30 min，隨后將其置于高溫或氧化壓力下，結果表明經熱處理后酵母中TPS1（海藻糖-6-磷酸合酶基因）上調，海藻糖積累較多，活性氧積累量減少；Desmond等[23]通過熱處理（52 ℃、15 min）方式提高Lactobacilli耐受力，噴霧干燥時，熱適應處理的乳桿菌活性增加18 倍。本研究結果也表明40 ℃熱處理40 min后膜醭畢赤酵母細胞內海藻糖含量升高（圖9A），有效提高真空干燥后膜醭畢赤酵母的活性（圖2）；唐飛等[24]在培養(yǎng)基中添加0.5%氯化鈉，干燥前對Rhodosporidium paludigenum 39 ℃熱激5 min，以20%脫脂乳為保護劑進行噴霧干燥時，干燥活菌數(shù)顯著提高；因此將酵母細胞短暫的暴露于一個非致死溫度下，可誘導酵母對更高溫度或其他極端環(huán)境的耐受力。

溫和氧化壓力可以提高酵母菌對后續(xù)不利環(huán)境的抵御能力，劉嘉等[12]用5 mmol/L過氧化氫對Candida oleophila處理30 min，增強酵母對隨后致死性氧化壓力（50 mmol/L H2O2），高溫（40 ℃）和低pH值（pH 4）的耐受性，氧化壓力為非生物脅迫，通過上調參與氧化應激的相關基因誘導提高酵母的耐受性，從而提高酵母生物防治效力；本研究選定5 mmol/L過氧化氫對膜醭畢赤酵母進行預適應處理（圖3），結果表明真空干燥后經過氧化氫預適應處理的酵母比對照組存活率高（圖4），且經過氧化氫預適應處理的酵母細胞中海藻糖積累較多（圖9B），說明經過氧化氫預適應處理后酵母細胞中應激保護性物質海藻糖含量升高提高了酵母的耐受性，從而使隨后在真空干燥后酵母存活率升高。

在培養(yǎng)基中加入酵母不可利用的組分可以誘導酵母細胞的滲透壓休克反應，如氯化鈉[13]，鹽脅迫誘導熒光假單胞菌EPS62e中海藻糖，N-乙酰谷氨酰胺和甘油葡糖苷的合成，但延緩菌體的生長速率[14]，滲透壓處理的方式提高生物防治劑Pseudomonas fluorescens在果實上的適應性，提高其對病原菌的防治功效；Wang Yifei等[25]在Rhodosporidium paludigenum培養(yǎng)基中添加6.6%氯化鈉調節(jié)水分活度為0.95，速凍后，處理組的酵母活性較對照組高；本研究也在培養(yǎng)基中添加不同濃度氯化鈉來提高酵母細胞的耐受力，結果顯示添加0.7 mol/L氯化鈉后誘導的酵母細胞內海藻糖產生量最高（圖9C），將添加不同濃度氯化鈉培養(yǎng)后的酵母在真空干燥條件下干燥后測定其活性，結果顯示在不添加任何保護劑時，添加0.7 mol/L和0.9 mol/L氯化鈉處理組的酵母活性較高（圖6A、B），而在添加保護劑的情況下，添加不同濃度氯化鈉處理的酵母干燥后活性基本無顯著性差異（圖6C、D），說明在該真空干燥過程中，保護劑對酵母活性的影響較大。

添加外源氯化鈣也可提高酵母細胞對熱的耐受力，如添加1 mmol/L或5 mmol/L氯化鈣增強酵母細胞抗氧化酶的活性、減少活性氧的積累、降低熱對酵母細胞內蛋白的氧化性損傷[15]；本研究也通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度氯化鈣提高酵母細胞的耐受力，結果顯示添加5 mmol/L氯化鈣后誘導的酵母細胞內海藻糖產生量最高（圖9D），將添加不同濃度氯化鈣培養(yǎng)后的酵母經真空干燥后測定其活性，結果顯示在不添加任何保護劑時，添加5 mmol/L氯化鈣培養(yǎng)后的酵母活性較高（圖8A、B），而在添加保護劑的情況下，添加不同濃度氯化鈣處理的酵母干燥后活性基本沒有顯著性差異（圖8C、D），同樣說明在真空干燥過程中，保護劑對酵母活性的作用較大。

除以上預處理方式外，還可使用抗壞血酸來增強酵母對氧化脅迫的耐受力。Li Chaolan等[26]通過250 μg/mL抗壞血酸處理提高Pichia caribbica氧化應激耐受性，經抗壞血酸處理的酵母表現(xiàn)出較高的生存力，細胞內活性氧水平也較低。還可在培養(yǎng)基中添加甘油、葡萄糖（水分活度=0.96）、海藻糖（水分活度=0.97）[27]、山梨醇（水分活度=0.98）[28]或檸檬酸[29]來調節(jié)培養(yǎng)基水分活度，使酵母細胞積累海藻糖，提高其耐受力。因此短暫的暴露于一個非致死逆境條件下，可誘導微生物對更極端環(huán)境的耐受力，并為其他逆境提供交叉保護。

綜上所述，熱處理、過氧化氫處理提高膜醭畢赤酵母對逆境的耐受力，即提高真空干燥后膜醭畢赤酵母的活性，如此以更經濟高效的方法制備酵母生防制劑，拓展生防保鮮劑的應用市場，從而使生防酵母的應用更為廣泛，真正實現(xiàn)其應用價值，有益于環(huán)境和人體健康。而在酵母培養(yǎng)基中添加氯化鈉、氯化鈣等預處理方式在不添加任何保護劑時，處理后的膜醭畢赤酵母經真空干燥后活性較未處理的高，在添加保護劑時，添加不同濃度氯化鈉處理和添加不同濃度氯化鈣處理后的膜醭畢赤酵母干燥后活性與未添加氯化鈉、氯化鈣的活性基本沒有顯著性差異，說明添加氯化鈉或氯化鈣培養(yǎng)后的膜醭畢赤酵母在真空干燥過程中，保護劑對其活性的影響更大。