乳桿菌發(fā)酵鱘魚骨酶解液條件優(yōu)化及營養(yǎng)成分分析

武瑞赟，杜怡麗，張金蘭，尹 劍，胡錦蓉，李平蘭*

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

魚骨中富含鈣、蛋白質(zhì)以及礦質(zhì)元素[1]，是營養(yǎng)豐富的天然資源，但由于鈣和蛋白質(zhì)分別以結(jié)合態(tài)形式[2]和三螺旋結(jié)構(gòu)的骨膠原形式[3]存在，均很難被機(jī)體吸收利用。酶解是提高蛋白質(zhì)功能特性的手段之一[4]，骨膠原在蛋白酶作用下降解為肽和少量氨基酸[5-6]，具有抗氧化、降血糖[7-8]等生理功能。通常鈣是在小腸部位以可溶性鈣離子的方式吸收利用的[9]，而單純的酶解并不能使魚骨中以羥基磷灰石Ca10(PO4)6OH結(jié)合態(tài)存在的鈣完全轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，導(dǎo)致魚骨中大量的鈣仍不能夠被利用。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵可以使羥磷石灰鈣轉(zhuǎn)變?yōu)橐子谖盏碾x子鈣[10]，因此，采用酶解與發(fā)酵相結(jié)合的手段可以進(jìn)一步提高魚骨的營養(yǎng)價值和利用率。

常用的發(fā)酵劑有酵母菌、葡萄球菌、微球菌以及乳酸菌[11]等，其中乳酸菌種類較多，發(fā)酵過程產(chǎn)酸[12]，有調(diào)節(jié)人體腸道微環(huán)境、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、增強(qiáng)抵抗力、抗腫瘤[13-15]等功能。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌能夠利用肽[16]、氨基酸為氮源生長[17]，所以酶解液可以為乳酸菌的生長提供天然底物，同時發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸性環(huán)境為骨中鈣由結(jié)合態(tài)分解為游離態(tài)提供了條件；微生物分泌的蛋白酶和肽酶[18-19]又可進(jìn)一步將長鏈肽水解為短肽，一些短肽可以與鈣、鎂等離子形成螯合物[20-21]，有利于機(jī)體的吸收，提高生物利用率。

L-ZS9是本實(shí)驗室從比利時發(fā)酵肉制品Saucisson sec pur中分離得到的1 株類植物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum），是國內(nèi)首個在GenBank上提交全基因序列的類植物乳桿菌[22]。前期研究發(fā)現(xiàn)，該菌株生長速度快，產(chǎn)酸能力強(qiáng)，與腸細(xì)胞有很好的黏附作用，并可產(chǎn)生雙肽細(xì)菌素（IIb類）[23-24]，具有良好的競爭優(yōu)勢。同時，該菌株還存在調(diào)控生物被膜形成的LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)[25-26]，有利于菌株耐受消化道環(huán)境及在腸道內(nèi)黏附定植，顯示出具有開發(fā)成為益生菌產(chǎn)品或發(fā)酵劑的潛力。

目前，國內(nèi)外利用乳酸菌發(fā)酵骨粉酶解液的相關(guān)研究很少，本研究以鱘魚軟骨酶解液為材料，類植物乳桿菌L-ZS9為發(fā)酵劑，通過單因素試驗及響應(yīng)面法優(yōu)化適合類植物乳桿菌L-ZS9生長的最佳發(fā)酵條件，同時考察發(fā)酵對酶解液中鈣、鎂、磷等營養(yǎng)成分的影響，為開發(fā)富含益生菌及多種營養(yǎng)成分的新型骨產(chǎn)品提供技術(shù)支撐，同時為禽畜骨的高值利用和新產(chǎn)品開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱘魚由北京市農(nóng)科院水產(chǎn)所十渡鱘魚繁育基地提供，為史氏鱘和西伯利亞鱘雜交品種；類植物乳桿菌L-ZS9，由本實(shí)驗室分離并保存。

MRS肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；瓊脂 寶如億（北京）生物技術(shù)有限公司；葡萄糖 西隴科學(xué)股份有限公司；氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）北京化工廠；鈣試劑盒、磷試劑盒、鎂試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-12冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；FA1004電子分析天平 上海天平儀器廠；UV-1800紫外-可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器術(shù)有限公司；MET-30033757 pH計 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Sorvall Legend Micro 17微量臺式離心機(jī) 賽默飛世爾科技公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 蘇州培英實(shí)驗設(shè)備有限公司；YXQ-LS-SII全自動立式蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；DK-8B電熱恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DW-86W100超低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；FEI Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡 美國菲達(dá)康有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 鱘魚軟骨粉酶解液的制備

依據(jù)實(shí)驗室前期的實(shí)驗所得的條件，以料液比1∶25（g/mL），使用堿性蛋白酶與中性蛋白酶以3%加酶量2∶1混合，55 ℃酶解5 h可得到蛋白水解度較高的鱘魚軟骨粉酶解液。

1.3.2 菌株活化與保存

取適量實(shí)驗室保藏的類植物乳桿菌L-ZS9凍干粉溶解于0.85%生理鹽水中得菌液，取菌液接種于無菌MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h。連續(xù)接種3 代，每一代劃平板培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)，同時取菌液涂片固定，進(jìn)行革蘭氏染色，100 倍油鏡觀察菌體特征，確保操作無污染。連續(xù)接種3 代至菌株活力正常，轉(zhuǎn)接于磁珠菌種保存管，－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 發(fā)酵時間的選擇

以3%接種量將活化后菌株接種于初始pH 6.5的無菌鱘魚軟骨粉酶解液培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)0、12、24、36、48、60 h取樣，取適宜的3 個稀釋度各倒3 個平行平板菌落計數(shù)。

1.3.3.2 接種量的選擇

分別以2%、3%、4%、5%、6%不同接種量將活化后菌株接種于初始pH 6.5的無菌鱘魚軟骨粉酶解液培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，取適宜的3 個稀釋度各倒3 個平行平板菌落計數(shù)。

1.3.3.3 發(fā)酵起始pH值的選擇

以4%接種量將活化后菌株接種于起始pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的無菌鱘魚軟骨粉酶解液培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，平板菌落計數(shù)。

1.3.3.4 葡萄糖添加量的選擇

以4%接種量將活化后菌株接種于滅菌前分別添加0、10、20、30 g/L和40 g/L葡萄糖，初始pH 6.0的無菌鱘魚軟骨粉酶解液培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，平板菌落計數(shù)。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

利用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken模型，選擇發(fā)酵液中活菌數(shù)（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行發(fā)酵時間（A）、葡萄糖添加量（B）、發(fā)酵起始pH值（C）、接種量（D）4 個因素對發(fā)酵液活菌數(shù)的響應(yīng)面分析，優(yōu)化4 個因素的最優(yōu)水平組合。響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for response surface d esiiggnn

1.3.5 乳酸菌活菌數(shù)的測定

發(fā)酵液中活菌數(shù)按GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》中的方法測定。

1.3.6 掃描電鏡觀察骨粉微觀結(jié)構(gòu)變化

將酶解后及發(fā)酵后的鱘魚軟骨粉樣品用1 mL戊二醛固定，真空噴金2 次各60 s達(dá)到厚度為10 nm成像，使用FEI Quanta 200型環(huán)境掃描電鏡對樣品進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.7 營養(yǎng)成分測定

可溶性鈣含量由鈣試劑盒微孔板法測定；可溶性磷含量由磷試劑盒微孔板法測定；可溶性鎂含量由鎂試劑盒微孔板法測定；可溶性蛋白質(zhì)含量利用BCA蛋白定量試劑盒測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)均為平行測定3 次以上取平均值，并計算出正負(fù)標(biāo)準(zhǔn)偏差，用誤差線表示。采用Design-Export 8.0.6數(shù)據(jù)處理軟件對實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行處理，應(yīng)用中心點(diǎn)法對各組變量的計算結(jié)果進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

選取對發(fā)酵液活菌數(shù)影響顯著（P＜0.05）且貢獻(xiàn)值最高的發(fā)酵時間、接種量、起始pH值及葡萄糖添加量4因素進(jìn)行單因素試驗，結(jié)果見圖1。

圖1 發(fā)酵時間（A）、葡萄糖添加量（B）、發(fā)酵起始pH值（C）、接種量（D）對活菌數(shù)的影響Fig. 1 Effects of fermentation time (A), glucose addition (B), initial pH (C),inoculum size (D) on the number of live bacteria

由圖1可知，隨發(fā)酵時間、接種量、起始pH值及葡萄糖添加量的增加，活菌數(shù)都呈先增加后下降的趨勢，其中發(fā)酵時間為24 h時，活菌數(shù)達(dá)到最大值9.50×106CFU/mL，24 h之后，由于發(fā)酵液中的碳源、氮源等營養(yǎng)物質(zhì)的減少，以及菌體自身可能進(jìn)入衰亡期，使得活菌數(shù)有所下降（圖1A）；圖1B顯示，將葡萄糖添加量范圍控制在0～40 g/L之間，發(fā)酵24 h時，活菌數(shù)結(jié)果顯示在20 g/L得到活菌數(shù)值最大為2.34×107CFU/mL。在固定發(fā)酵時間24 h、葡萄糖添加量20 g/L的情況下，圖1C顯示，發(fā)酵起始pH 6.0時，活菌數(shù)達(dá)最大值為5.01×107CFU/mL。固定以上因素，由圖1D可知，在接種量為4%時，活菌數(shù)達(dá)最大值8.37×108CFU/mL，隨著接種量的增加，活菌數(shù)有所下降，可能是由于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的局限性，不能供給微生物更多的營養(yǎng)，微生物生長受到限制，活菌數(shù)有所下降。另外，考慮到過高的接種量對發(fā)酵體系物質(zhì)消耗的因素以及菌體自溶帶來的影響，確定4%為適宜接種量；通過單因素試驗得到的最適發(fā)酵時間、接種量、起始pH值及葡萄糖添加量分別為24 h、4%、6.0和20 g/L。

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化的試驗方案及結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計Box-Behnken模型，共得到29 個試驗組，并按照方案進(jìn)行試驗，以活菌數(shù)為響應(yīng)值（Y），試驗方案及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

2.2.2 響應(yīng)面模型方差分析

根據(jù)試驗結(jié)果建立回歸模型并進(jìn)行方差分析，如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic polynomial regression model

由表3可知，所選模型P值小于0.000 1，高度顯著，說明與實(shí)際情況擬合良好；失擬項P值大于0.05，不顯著，說明未知因素對試驗結(jié)果干擾小，模型選擇適當(dāng)。同時，該模型的決定系數(shù)為0.936 1，說明該方程與實(shí)際情況擬合良好，較好地反映了發(fā)酵液中活菌數(shù)與發(fā)酵時間、接種量、發(fā)酵起始pH值和葡萄糖添加量之間的相互作用關(guān)系，因此該模型可用。利用Design-Expert 8.0.6對表3所顯示的結(jié)果進(jìn)行二次多元擬合處理，得到發(fā)酵液中活菌數(shù)（Y）對發(fā)酵時間（A）、葡萄糖添加量（B）、發(fā)酵起始pH值（C）和接種量（D）的二次多元回歸方程為：Y=8.28－0.10A－0.067B－0.027C+0.083D－0.004 17AB+0.008 51AC+0.00322AD+0.013BC+0.042BD+0.010CD－0.15A2－0.097B2－0.14C2－0.13D2。

圖2 各因素交互作用響應(yīng)面和等高線圖Fig. 2 Response surface and contour plots showing the interactive effect of variables on L. paraplantarum growth

所得二次回歸方程的響應(yīng)面圖和等高線見圖2，通過方程可知，二次項系數(shù)為負(fù)值，表明方程具有最大值。得到等高線呈橢圓狀，拋物面朝下，說明模型存在最大值，模型建立良好。軟件分析得到最優(yōu)工藝為發(fā)酵時間20.07 h、葡萄糖添加量17.11 g/L、發(fā)酵起始pH 5.95、接種量4.27%，并預(yù)測在此條件下活菌數(shù)為2.09×108CFU/mL，按照此工藝進(jìn)行驗證實(shí)驗，所得結(jié)果為3.55×108CFU/mL，與預(yù)測值基本吻合，說明模型很好地預(yù)測了實(shí)驗結(jié)果。

2.3 掃描電鏡觀察發(fā)酵前后鱘魚骨粉酶解液的微觀結(jié)構(gòu)變化

圖3 酶解（a）及發(fā)酵后（b）鱘魚軟骨粉電鏡形態(tài)圖（×30 000）Fig. 3 Morphology of sturgeon cartilage powder after enzymatic hydrolysis (a) and fermentation (b)

圖3a是酶解后的鱘魚軟骨粉，其邊緣銳利，整體結(jié)構(gòu)疏松分散，這可能是由于蛋白酶水解了骨粉中結(jié)構(gòu)蛋白，導(dǎo)致骨的內(nèi)部結(jié)構(gòu)分離，呈現(xiàn)松散狀態(tài)，這與秦娜娜等[27]探究木瓜蛋白酶水解骨粉最佳工藝條件時得到的骨粉粒徑明顯小于未酶解前的骨粉粒徑的結(jié)果一致。發(fā)酵后的鱘魚軟骨粉（圖3b）表面呈多孔狀，致密結(jié)構(gòu)被破壞，同時可見骨粉中活菌含量豐富。發(fā)酵后骨粉結(jié)構(gòu)與劉麗莉等[28]對牛骨粉發(fā)酵前后的電鏡觀察所發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相似，對比發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程對鱘魚骨粉顆粒表面的微觀結(jié)構(gòu)影響顯著，與未經(jīng)發(fā)酵的鱘魚軟骨酶解粉的完整結(jié)構(gòu)相比較，推測發(fā)酵過程促使骨粉表面發(fā)生“侵蝕”的原因，主要是由于菌體代謝產(chǎn)生胞外膠原蛋白酶降解了骨中的膠原蛋白，從而破壞了骨的完整結(jié)構(gòu)，使結(jié)合緊密的骨粉顆粒變得疏松，骨中的膠原蛋白肽更好地溶出，發(fā)酵液中氮源更加充足，這也為類植物乳桿菌L-ZS9的生長提供了營養(yǎng)支持，起到促生長作用。

2.4 鱘魚骨酶解液發(fā)酵前后營養(yǎng)成分

發(fā)酵前后功能成分及一般營養(yǎng)成分測定結(jié)果見表4。經(jīng)測定，該產(chǎn)品活菌數(shù)可達(dá)（3.55±0.10）×108CFU/mL，滿足益生菌在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用活菌數(shù)108～109CFU/mL的要求[29]。

表4 鱘魚骨酶解液發(fā)酵前后營養(yǎng)成分測定結(jié)果Table 4 Changes in macronutrients of the hydrolysate before and after fermentation

鈣、磷、鎂是人體的重要組成物質(zhì)，具有廣泛的生理功能，由于日常生活的磷攝入過多，過多的磷經(jīng)過會帶體內(nèi)的鈣分子排出體外，造成缺鈣現(xiàn)象的發(fā)生；鎂是骨骼中鈣進(jìn)入血液的控制開關(guān)，單獨(dú)攝取鈣質(zhì)可能造成鎂的缺乏，同時，鎂又可以與體內(nèi)的游離鈣結(jié)合，鈣、磷、鎂比例適宜，才更有利于人體消化吸收[30-31]，達(dá)到補(bǔ)鈣的目的?？扇苄缘鞍字缚梢砸孕》肿訝顟B(tài)溶于水或其他溶劑的蛋白，通常在微生物、食品加工等中作為重要指標(biāo)，是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，具有提高細(xì)胞的保水能力、保護(hù)細(xì)胞及生物膜的作用。因此本研究對酶解液和發(fā)酵液中可溶性的鈣、鎂、磷以及可溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行了營養(yǎng)指標(biāo)測定。

如表4所示，發(fā)酵液中游離鈣、鱗、鎂含量較骨粉酶解液原料均有提高。說明在L-ZS9發(fā)酵過程中，代謝產(chǎn)物中的蛋白酶系進(jìn)一步使酶解液中蛋白發(fā)生降解，使得一部分蛋白質(zhì)溶出，可溶性蛋白含量略有所增加。也可以改變骨的結(jié)構(gòu)，使更多的鈣流出，同時發(fā)酵產(chǎn)酸，提供酸性環(huán)境，骨中的羥磷灰石態(tài)鈣變成可溶的游離鈣釋放出來。同時發(fā)酵液中的鈣、磷、鎂約為4∶2∶1，符合中國營養(yǎng)學(xué)會提出的膳食鈣磷鎂比例，由此可見，利用類植物乳桿菌L-ZS9發(fā)酵鱘魚軟骨酶解液，可制得含益生菌的發(fā)酵魚骨類補(bǔ)鈣產(chǎn)品。

3 結(jié) 論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計響應(yīng)面試驗，優(yōu)化出乳桿菌發(fā)酵鱘魚骨酶解液的最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵時間20.07 h、葡萄糖添加量17.11 g/L、發(fā)酵起始pH 5.95、接種量4.27%，在此條件下發(fā)酵液中乳桿菌活菌數(shù)可達(dá)（3.55±0.10）×108CFU/mL。同時，乳桿菌的發(fā)酵可顯著提高鱘魚骨酶解液中游離鈣含量。本研究利用類植物乳桿菌L-ZS9對鱘魚骨酶解液進(jìn)行發(fā)酵，使其兼具了益生、補(bǔ)鈣的特性，實(shí)現(xiàn)了魚骨的高值利用，為相關(guān)功能產(chǎn)品的研發(fā)提供理論支持。