洪澤翰,吳婉儀,李 璐*,李 雁,解新安
(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東 廣州 510000)
番茄紅素是類胡蘿卜素的一種,外觀呈深紅色晶體,廣泛分布在各種成熟生果蔬菜中[1]。相關(guān)研究證實,番茄紅素在防治疾病、提高機(jī)體健康水平方面的功能活性主要是通過防止人體細(xì)胞被氧化來實現(xiàn)[2]。但其結(jié)構(gòu)中存在多個不飽和雙鍵直接導(dǎo)致番茄紅素易受光照、溫度、氧氣、酸堿度、金屬離子及催化劑的作用而發(fā)生氧化分解,使其在應(yīng)用中具有一定困難。作為一種載運體系,納米乳液技術(shù)可用來改善這類營養(yǎng)素的水分散性和穩(wěn)定性,提高生物利用率,因而引起醫(yī)藥、食品領(lǐng)域研究者的廣泛關(guān)注[3]。近年來,許多學(xué)者嘗試將番茄紅素包埋于納米乳液中,研究乳化-蒸發(fā)法或高壓均質(zhì)法等不同的構(gòu)建方式及條件[4-5];研究不同種類的乳化劑和油水比[6-7]等對番茄紅素納米乳液穩(wěn)定性和生物利用率等的影響,結(jié)果表明納米乳液可顯著提高所包埋番茄紅素的穩(wěn)定性和物利用率,如Ho等[6]發(fā)現(xiàn)通過納米乳液負(fù)載,番茄紅素在避光4 ℃貯藏14 d后的保留率可達(dá)到65%以上;Amiri-Rigi等[7]使用輔助表面活性劑從番茄工業(yè)廢物中回收番茄紅素,回收率可達(dá)35%,效率提高6 倍;Ha等[8]發(fā)現(xiàn)通過納米乳液包埋,番茄紅素的生物利用率從1%提高到53%。
在構(gòu)建穩(wěn)定的納米乳液時,乳化劑起著非常重要的作用,它需要在乳液體系中顯示出良好的表面活性和產(chǎn)生低界面張力,以及單獨或與已經(jīng)在界面吸附的組分形成界面膜[8-9]。雖然相關(guān)的毒性報道并不常見,但為避免小分子表面活性劑使用時帶來的潛在毒性,選擇較為安全的生物兼容大分子乳化劑,是目前構(gòu)建納米乳液的重要發(fā)展方向。利用辛烯基琥珀酸酐改性后得到的辛烯基琥珀酸酯化(octenyl succinic anhydride,OSA)變性淀粉被美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證為安全乳化劑,不僅價格便宜,且受體系離子強(qiáng)度及酸堿度影響小,具有很好的乳化穩(wěn)定性和乳化活性[10]。而蛋白類乳化劑的主要代表有乳清分離蛋白(whey protein isolate,WPI)、酪蛋白酸鈉(sodium caseinate,SC)等,它們均具有良好的乳化能力,能有效地降低油水界面張力,且來源十分安全,因此這些乳化劑被廣泛應(yīng)用于負(fù)載營養(yǎng)物的納米乳液的構(gòu)建[11]。有研究表明乳化劑種類是影響納米乳液消化特性的重要因素,伴隨著人體消化道內(nèi)不同部位復(fù)雜的物理化學(xué)和生物學(xué)條件如pH值、離子強(qiáng)度、消化酶、剪切力等[12-15],納米乳液的結(jié)構(gòu)和所運載的營養(yǎng)素的存在形式都會發(fā)生顯著變化,并對乳液的生物學(xué)效應(yīng)和生物安全性產(chǎn)生影響,因此研究不同乳化劑所構(gòu)建納米乳液的消化規(guī)律是非常有必要的,然而相關(guān)研究并不多見,對淀粉類和蛋白質(zhì)類乳化劑消化規(guī)律的比較更是鮮見報道。
本研究以生物大分子OSA變性淀粉、WPI和SC為乳化劑構(gòu)建番茄紅素納米乳液,詳細(xì)分析3 種大分子乳化劑制得乳液在口腔、胃、腸消化過程及膠束消化液中粒徑、Zeta電位的變化,比較體外消化后游離脂肪酸釋放率以及番茄紅素的生物利用度的變化規(guī)律,以期為選用生物大分子乳化劑構(gòu)建納米乳液用于番茄紅素等生物活性物質(zhì)的運輸提供理論支持。
OSA變性淀粉 廣東佛山德峰淀粉糖業(yè)有限公司;WPI、SC 廣州市齊云生物技術(shù)有限公司;中鏈甘油三酯(medium chain triglycerides,MCT) 廣州耶尚貿(mào)易公司;番茄紅素(純度90%)、尿素、尿酸、α-淀粉酶(4 000 U/g)、胰脂酶(30 000 U/g)、胃蛋白酶(USP級,1∶3 000)、豬膽酸鹽、糖化酶(100 000 U/g)、尼羅紅 上海源葉生物科技有限責(zé)任公司;其他常規(guī)分析純級試劑購自廣州化學(xué)試劑廠。
Scientz-150型高壓均質(zhì)機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;FJ200型高速分散均質(zhì)攪拌器 上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司;HJ-6B型多頭數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 常州市萬合儀器制造有限公司;ZetasizerNano ZS90型納米粒度及Zeta電位分析儀 英國Malvern公司;Centrifuge5804 R型離心機(jī) 德國Eppendorf股份公司;DL55型滴定儀 美國Mettler Toledo公司;780 Live型激光掃描共聚焦顯微鏡 德國蔡司公司。
1.3.1 負(fù)載番茄紅素的納米乳液體系的構(gòu)建
在課題組前期工作的基礎(chǔ)上[5],以3 種乳化劑的較優(yōu)使用量分別構(gòu)建番茄紅素納米乳液,具體如下:以去離子水或磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)作為連續(xù)相,以MCT油為載體油構(gòu)建負(fù)載番茄紅素的O/W納米乳液體系。不同乳化劑體系的連續(xù)相處理方式不同:淀粉連續(xù)相為將30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))OSA變性淀粉分散在去離子水中,溶解溫度和溶解時間為70 ℃和15 min,而后在室溫(25 ℃)100 r/min磁力攪拌過夜(12 h);而蛋白質(zhì)類連續(xù)相為1% WPI(質(zhì)量分?jǐn)?shù))及2% SC(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分散在磷酸鹽緩沖溶液中,并在室溫(25 ℃)100 r/min磁力攪拌4 h,而后在4 ℃的冰箱中貯藏過夜(12 h)。分散相制備方法均為在溫和加熱(小于5 min,50 ℃)條件下,在MCT油中分散載量為0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品,100 r/min磁力攪拌1 h以確保其完全溶解。然后將連續(xù)相與分散相按9∶1的比例混合,磁力攪拌均勻后在高速分散機(jī)上以10 000 r/min分散5 min制得粗乳液,再將制得的粗乳液通過高壓均質(zhì)機(jī)在110 MPa下循環(huán)均質(zhì)3 次以形成O/W納米乳液。為保護(hù)對光熱敏感的番茄紅素,在制備納米乳液過程中使用錫箔以保證其最小化暴露于光。
1.3.2 模擬消化道的構(gòu)建
根據(jù)人體和動物消化道的構(gòu)造,構(gòu)建3個階段模擬消化道[16],包括模擬口腔、模擬胃和模擬腸階段。
模擬口腔消化階段:稱取4 mL納米乳液樣品與4 mL模擬口腔液(含0.896 g/L KCl、0.2 g/L KSCN、0.888 g/L NaH2PO4、0.57 g/L Na2SO4、0.298 g/L NaCl、1.694 g/L NaHCO3、0.2 g/L尿素、0.015 g/L尿酸和0.6 g/L α-淀粉酶)混合,穩(wěn)定溫度在37 ℃,調(diào)節(jié)pH 7.0,并在100 r/min下攪拌3 min以模擬口腔消化[17]。
模擬胃消化階段:配制10 mL模擬胃液(含2 g/L NaCl和2 g/L胃蛋白酶)。在納米乳液樣品于模擬口腔液中消化3 min后,將提前制備的模擬胃液加入其中,然后用0.1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)體系pH值至2.0,同時穩(wěn)定消化液溫度為37 ℃。調(diào)節(jié)pH值后,將消化液樣品置于100 r/min條件下模擬胃液消化1 h[18]。
模擬腸液消化階段:消化液樣品在經(jīng)過模擬胃消化階段1 h后,使用0.25 mol/L的NaOH溶液將體系pH值調(diào)節(jié)到7.0。配制15 mL的模擬腸液(含0.244 2 g/L CaCl2、140 U糖化酶、44 g/L豬膽酸鹽和2.2 g/L胰脂肪酶),加入到經(jīng)過模擬胃階段消化1 h后的納米乳液消化液體系中,置于100 r/min條件下均勻攪拌,進(jìn)行模擬腸階段2 h的消化。在此消化過程中,根據(jù)pH-stat法,利用滴定儀不斷加入0.25 mol/L的NaOH溶液,使消化液pH值穩(wěn)定在7.0,同時穩(wěn)定消化液溫度為37 ℃。記錄滴定過程中隨時間的變化、消化液所消耗的NaOH溶液量[19-20]。消化液樣品經(jīng)過模擬消化的第3階段即模擬腸消化2 h后,平行取樣置于離心管中,10 000 r/min離心15 min。離心后的樣液分為3 層:最上一層是由未消化油形成的油脂層,中間一層是載有營養(yǎng)素的透明膠束層,底部是未完全消化的不溶物質(zhì)[21]。
1.3.3 模擬消化過程中乳液微觀形態(tài)的變化
1.3.3.1 模擬消化過程中乳液粒徑的變化
利用納米粒度及Zeta電位分析儀Zetasizer Nano ZS90(配有He/Ne激光器(λ=633 nm))對3 種大分子乳化劑(OSA變性淀粉、WPI和SC)優(yōu)化制備的納米乳液最初的粒徑以及經(jīng)過模擬口腔、模擬胃、模擬腸5 min、模擬腸120 min和膠束消化液的粒徑進(jìn)行測定。所有樣品測試前先使用去離子水或磷酸鹽緩沖溶液對原乳液稀釋100 倍,然后吸取適量(約為比色皿的2/3)的待測液加入石英比色皿中,測試參數(shù)為水折射率1.33、測試溫度25 ℃,每個樣品平行測定3 次,取平均值。
1.3.3.2 模擬消化過程中納米乳液表觀結(jié)構(gòu)的變化
根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道[22-23]的方法,采用激光掃描共聚焦顯微鏡對消化過程中3 種番茄紅素納米乳液的表觀形態(tài)進(jìn)行觀察。以無水乙醇為溶劑,配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%的尼羅紅染液,并置于4 ℃冰箱貯藏。在3 種乳化劑構(gòu)建的番茄紅素納米乳液模擬消化的過程中,分別取原始乳液、模擬口腔、模擬胃和模擬腸的樣品后染色,樣品中尼羅紅最終質(zhì)量濃度為0.25 μg/mL。取染色后的樣品10 μL,滴加到載玻片上后迅速蓋上蓋玻片,放置在激光掃描共聚焦顯微鏡上后,使用10 倍目鏡和100 倍物鏡,顯微鏡的實驗參數(shù)為激發(fā)波長543 nm,吸收波長563~733 nm。
1.3.4 模擬消化過程中乳液電位的變化
樣品的前期處理和測試操作同1.3.3節(jié),利用納米粒度及Zeta電位分析儀(配有He/Ne激光器(λ=633 nm))測定番茄紅素納米乳液在不同模擬消化階段時的電位。
1.3.5 乳化劑種類對納米乳液游離脂肪酸釋放的影響
在模擬腸的消化過程中,納米乳液中的油脂在胰脂肪酶的作用下被水解成游離脂肪酸,所以在水解過程中消化液體系會不斷地產(chǎn)生H+,從而導(dǎo)致pH值降低。在模擬腸消化過程中,根據(jù)pH-stat法,利用NaOH溶液平衡消化液體系的pH值。利用消耗的NaOH溶液的體積,計算出番茄紅素納米乳液體系中釋放的游離脂肪酸量,計算釋放率公式如下:
式中:V(NaOH)為產(chǎn)生游離脂肪酸所消耗的NaOH溶液體積/mL;C(NaOH)為NaOH溶液的濃度/(mol/L);Mlipid為MCT油脂的平均分子質(zhì)量/(g/moL);mlipid為最初存于納米乳液中載物油的質(zhì)量/g。
1.3.6 模擬消化后乳液中番茄紅素生物利用率的測定
番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:番茄紅素溶液在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)滿足朗伯-比爾定律[24],用二氯甲烷溶液溶解番茄紅素標(biāo)品,通過紫外-可見光分光光度計在400~600 nm波長范圍內(nèi)全波長掃描,番茄紅素吸收圖譜顯示其在472 nm波長處有明顯的吸收峰。使用少量二氯甲烷溶解番茄紅素標(biāo)品,以二氯甲烷-正己烷(1∶3,V/V)為混合溶劑,配制質(zhì)量濃度為0.2~40 μg/mL的番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液,繪制的番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.051C-0.008,相關(guān)系數(shù)r為0.996 1。
番茄紅素質(zhì)量濃度的測定:取500 μL新制的番茄紅素乳液樣品與500 μL的二甲基亞砜溶液均勻混合,然后依次加入2 mL的二氯甲烷-正己烷(1∶3,V/V)混合有機(jī)相進(jìn)行萃取,重復(fù)萃取3 次,直至樣品變澄清,而后合并萃取液,在4 000 r/min離心10 min,取上層清液置于分光光度計下測定番茄紅素的吸光度。以混合有機(jī)相作為空白對照,測定波長為472 nm,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算番茄紅素質(zhì)量濃度。
3 種乳化劑構(gòu)建的番茄紅素納米乳液經(jīng)模擬口腔、胃和腸階段消化后,消化液離心后得到膠束液。取1 mL膠束液,使用以上方法測定膠束中的番茄紅素質(zhì)量濃度,并通過式(2)計算番茄紅素納米乳液經(jīng)消化后的生物利用率。
式中:C0為納米乳液中番茄紅素質(zhì)量濃度/(μg/mL);C1為膠束中番茄紅素質(zhì)量濃度/(μg/mL)。
所有實驗都至少重復(fù)3 次并取平均值,使用Microsoft Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,計算標(biāo)準(zhǔn)偏差,使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析,使用Origin 8.5軟件制圖。
圖1 不同乳化劑構(gòu)建的番茄紅素納米乳液在模擬消化過程中粒徑的分布Fig. 1 Particle size distribution of three lycopene nanoemulsions prepared with different emulsifiers during simulated digestion
納米乳液的平均粒徑直接影響包埋物在消化過程中的生物利用度。由圖1和圖2可知,3 種納米乳液在模擬消化過程中粒徑變化趨勢為先增加后降低,其中OSA變性淀粉納米乳液經(jīng)過模擬口腔液和胃液后粒徑增加較少,在模擬腸消化5 min粒徑急劇增大,這是因為OSA變性淀粉增大了乳液體系對α-淀粉酶的抗酶解作用,而腸液中含有的胰淀粉酶和糖苷酶使OSA變性淀粉大量水解崩壞,從而使體系粒徑在此階段急劇增大。陳翰[17]使用3 種淀粉類乳化劑構(gòu)建的納米乳液在模擬腸消化階段中二糖的生成量大量增加,表明在腸消化階段淀粉被大量水解;而蛋白質(zhì)類的納米乳液在模擬胃階段時粒徑急劇增大,這可能是因為胃液中的蛋白酶大量水解WPI和SC,從而導(dǎo)致了以蛋白質(zhì)為乳化劑的乳液體系粒徑在此階段增大。Malaki等[25]研究也指出,乳化劑被分解會使乳液的結(jié)構(gòu)被破壞,從而發(fā)生大量聚集,體系的粒徑急劇增大。
圖2 不同乳化劑構(gòu)建的番茄紅素納米乳液在模擬消化過程中平均粒徑的變化Fig. 2 Change in average particle size of three lycopene nanoemulsions prepared with different emulsifiers during simulated digestion
圖3 3 種不同乳化劑制備的番茄紅素納米乳液在模擬消化中的形貌圖Fig. 3 Morphology of lycopene nanoemulsion prepared by three different emulsifiers during simulated digestion
為便于觀察,可使用通過尼羅紅染色的方法來觀察油脂變化情況[26-27]。利用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測,由圖3可以看出,3 種番茄紅素納米乳液在消化過程中的聚集變化情況與粒徑變化的結(jié)果相一致,原始的納米乳液顯微鏡圖中觀察不到油滴顆粒,但經(jīng)模擬消化后觀測到油滴顆粒聚集現(xiàn)象的出現(xiàn),即3 種納米乳液在不同消化階段發(fā)生了不同程度的水解。OSA變性淀粉構(gòu)建的番茄紅素納米乳液在模擬口腔階段便可觀察到油滴顆粒,而蛋白質(zhì)類乳化劑構(gòu)建的番茄紅素納米乳液在模擬胃階段發(fā)生的油滴聚集較為劇烈。
圖4 3 種番茄紅素納米乳液在模擬消化過程中電位的變化Fig. 4 Change in potential of three lycopene nanoemulsions during simulated digestion
利用Zeta電位分析儀檢測可知(圖4),OSA變性淀粉構(gòu)建的納米乳液電位絕對值呈現(xiàn)出先增大后減小又增大的趨勢,而蛋白質(zhì)類乳化劑構(gòu)建的納米乳液電位均為先減小后增大的趨勢,且OSA變性淀粉構(gòu)建的納米乳液電位絕對值整體比蛋白質(zhì)類大。Zeta電位表示液滴的靜電排斥力,其值越高,乳液的穩(wěn)定性越好。另外,乳液電位的變化與粒徑變化的規(guī)律相應(yīng),OSA變性淀粉納米乳液的電位絕對值在模擬腸5 min階段達(dá)最低,而蛋白質(zhì)類的納米乳液電位絕對值的最低點在模擬胃階段。這是因為對于蛋白質(zhì)類納米乳液,胃階段的pH值在蛋白質(zhì)乳化劑WPI和SC的等電點附近,粒子間的靜電排斥作用減少,體系的電位絕對值低。
以溶有同等質(zhì)量濃度番茄紅素的MCT油為對照組,比較3 種番茄紅素納米乳液在模擬腸階段后的游離脂肪酸釋放率,如圖5所示。
圖5 3 種番茄紅素納米乳液與對照組在模擬腸消化過程中的游離脂肪酸釋放率Fig. 5 FFA release from three lycopene nanoemulsions and control group during simulated intestinal digestion
經(jīng)過小腸階段的模擬消化后,3 種乳化劑構(gòu)建的番茄紅素納米乳液的消化速率大小排序為SC>W(wǎng)PI>OSA變性淀粉>對照組,游離脂肪酸釋放率的大小排序為OSA變性淀粉(92.25%)>SC(86.53%)>W(wǎng)PI(79.88%),高于對照組的48.7%,這一結(jié)果證明,納米乳液運載體系能有效地改善油脂的消化[28]。這是因為納米級的乳液油水體系增大了脂肪酶與油滴的接觸面積,從而提高脂肪的水解速度。而不同種類的大分子乳化劑有著不同的化學(xué)結(jié)構(gòu),因而在人體消化過程中酶解情況不同,從而導(dǎo)致游離脂肪酸釋放率不同。通常,乳化劑的消化速率越快,顆粒的聚集也越快,使得油滴總的表面積減少,導(dǎo)致較低的游離脂肪酸釋放率[29]。蛋白質(zhì)類納米乳液油脂的消化速率高于OSA變性淀粉,原因是腸液中的胰淀粉酶和糖苷酶大量水解了OSA變性淀粉,對脂肪消化起了抑制作用。對于蛋白質(zhì)類納米乳液,SC較WPI更容易被脂肪酶水解,這是因為SC表觀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)多孔凹狀,易于膽鹽等分子的吸附[30]。
納米乳液體系所包埋的營養(yǎng)素,在模擬腸消化階段中,由于載物油被水解,營養(yǎng)素會逐漸從載物油中釋放出來,有研究表明大部分營養(yǎng)素會以膠束的形式被小腸所吸收[31]。因此,在體外模擬消化過程中,納米乳液中的番茄紅素生物利用率轉(zhuǎn)換為膠束中的濃度百分比計算。以溶有同等質(zhì)量濃度番茄紅素的MCT油為對照組,圖6為3 種番茄紅素納米乳液和對照組經(jīng)過模擬人體消化后番茄紅素的生物利用率。
圖6 3 種番茄紅素納米乳液與對照組的番茄紅素生物利用率Fig. 6 Bioavailability of lycopene in three lycopene nanoemulsions and control
由圖6可知,由O S A變性淀粉、S C和W P I構(gòu)建的納米乳液番茄紅素的最終生物利用率分別為(25.60±3.08)%、(18.70±1.14)%、(14.05±1.23)%,遠(yuǎn)大于對照組的(1.06±0.06)%。結(jié)果證明納米乳液體系包埋的番茄紅素具有較好的生物利用率,且以O(shè)SA變性淀粉為乳化劑的納米乳液番茄紅素的生物利用率高于蛋白質(zhì)類,此結(jié)果與游離脂肪酸釋放率的結(jié)果呈正相關(guān),這是因為體系中膠束的形成與體系中脂肪水解的程度有關(guān),脂肪水解程度越低,體系中膠束越難以形成,從而導(dǎo)致了番茄紅素生物利用率較低,這與梁蓉[32]的研究結(jié)果一致。Mcclements等[33]研究表明,在包埋有營養(yǎng)素的納米乳液中,營養(yǎng)素的攝取吸收率要明顯強(qiáng)于溶解于水中或者油系中的攝取率,且其效率會因粒徑的不斷減小而明顯增強(qiáng)。但也存在部分的納米載體顆粒,結(jié)構(gòu)牢固、穩(wěn)定性較強(qiáng),經(jīng)過上皮細(xì)胞吸收并進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)的過程后,仍能夠以納米顆粒的穩(wěn)定形式存在,不會輕易被細(xì)胞代謝,其中的營養(yǎng)素也無法釋放,因此難以被利用??梢?,在構(gòu)建每一個納米乳液體系時,應(yīng)當(dāng)使粒徑范圍控制至某一合適的區(qū)間內(nèi),這樣才能使其生物利用率最優(yōu)化。
通過高壓均質(zhì)的方法,分別以O(shè)SA變性淀粉、WPI和SC為乳化劑構(gòu)建番茄紅素納米乳液,以粒徑、Zeta電位、游離脂肪酸釋放率以及番茄紅素生物可利用度為指標(biāo),探討3 種番茄紅素納米乳液在口腔、胃、腸中的消化規(guī)律。在口腔消化階段,3 種納米乳液的粒徑并無明顯變化;在胃消化階段,蛋白質(zhì)類乳化劑構(gòu)建的納米乳液粒徑顯著增大,且電位絕對值達(dá)到最低;在腸消化階段,OSA變性淀粉構(gòu)建的納米乳液粒徑明顯增加,電位絕對值降到最小。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示OSA變性淀粉和蛋白質(zhì)類大分子構(gòu)建的納米乳液分別在腸和胃階段發(fā)生大量水解。蛋白質(zhì)類納米乳液油脂的消化速率高于OSA變性淀粉,但OSA變性淀粉納米乳液擁有更高的游離脂肪酸釋放率。3 種納米乳液的生物利用率均遠(yuǎn)高于對照組,且OSA變性淀粉構(gòu)建的番茄紅素納米乳液能表現(xiàn)出更高的生物利用率。因此,可以認(rèn)為OSA變性淀粉是構(gòu)建負(fù)載營養(yǎng)物納米乳液的更為優(yōu)良的大分子乳化劑。