接種量對(duì)草莓酒發(fā)酵特性的影響

馬欣娟，呂慧威，孫玉梅*

（1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.吉林師范大學(xué) 博達(dá)學(xué)院，吉林 四平 136000）

草莓（Fragaria ananassa）營(yíng)養(yǎng)豐富，果實(shí)鮮紅色，質(zhì)軟而多汁，香味濃厚，略酸微甜，富含多糖、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)及多酚類生物活性物質(zhì)，具有抗癌、抗氧化、預(yù)防心血管疾病等多種功效[1]，深受大眾喜愛。草莓的收獲期十分集中，保質(zhì)期短，采摘之后極易碰傷變質(zhì)，貯藏運(yùn)輸中腐爛比例較高[2]。將草莓加工成兼具風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)的果酒，是提高草莓利用價(jià)值的一種重要途徑。

影響果酒發(fā)酵特性的因素有很多，其中酵母菌接種量是一個(gè)比較重要的因素。在果酒的釀造中，酵母菌主導(dǎo)酒精發(fā)酵的過(guò)程，一般認(rèn)為，接種量越大，起酵時(shí)間越短，降糖速率越高，耗糖量也越大。但是，較高的接種量卻導(dǎo)致酒精度降低，酒體中的雜醇油含量升高，酯類含量減少[3-5]。然而，酵母接種量較低時(shí)，整個(gè)酒精發(fā)酵過(guò)程緩慢，最終釀制的果酒中酒精度較低，揮發(fā)酸的量較高，由此可見，過(guò)低的酵母接種量也不利于果酒的釀造[4，6]。對(duì)于不同的果酒，最適宜的酵母接種量也不一樣，西瓜酒的最佳干酵母用量為0.4 g/L[6]，芡實(shí)酒適宜的干酵母用量為0.5 g/L[7]，桑葚酒干酵母用量為0.6 g/L時(shí)發(fā)酵效果最好[8]，葡萄酒的最適接種量一般在1×106～1×107CFU/mL[9]。目前，對(duì)草莓酒的研究大都集中在發(fā)酵工藝[10]、釀酒微生物及草莓酒發(fā)酵特性方面[11]，對(duì)其接種量的研究較少。

本研究以裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）為發(fā)酵菌株，分別采用不同接種量（3%、5%、7%、9%（V/V））進(jìn)行草莓酒發(fā)酵，并通過(guò)測(cè)定降糖速率、產(chǎn)酒精能力、產(chǎn)酸量及香氣成分含量，考察不同接種量對(duì)草莓酒發(fā)酵特性的影響，以期確定較適宜的接種量，為草莓酒的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豐香草莓：大連市水果市場(chǎng)；裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）：本實(shí)驗(yàn)室選育及保藏[12]。

果膠酶（酶活20萬(wàn)U/g）：河南洛陽(yáng)夏盛果汁果膠酶有限公司；二氯甲烷（分析純）：北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；主要香氣成分（正丙醇、異丁醇、乙酸異戊酯、正丁醇、乙酸正戊酯、己酸甲酯、異戊醇、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、β-苯乙醇）標(biāo)準(zhǔn)品：天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S-3C雷磁pH值計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；WYT-5手持糖量折光儀：上海大慶光學(xué)儀器廠；GC8900型氣相色譜儀：山東經(jīng)緯分析儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 草莓酒加工工藝流程及操作說(shuō)明

草莓→揀選→破碎→果漿→調(diào)配→酶解→接種發(fā)酵→成品

果漿制備：選擇成熟度較高、無(wú)霉?fàn)€和損傷的草莓鮮果，除萼片，采用榨汁機(jī)適度破碎，得草莓果漿。

調(diào)配：在果漿中加蔗糖調(diào)整糖分為22°Bx，并在其中加入60 mg/L SO2（偏重亞硫酸鉀）和0.05%果膠酶。

酶解：加入0.05%果膠酶，在40℃酶解90 min。

酵母活化液制備：取10°Bx麥汁斜面保藏的酵母菌種2環(huán)，接入5 mL濃度為10%蔗糖水溶液中，于30℃靜置培養(yǎng)24 h。將上述培養(yǎng)液接入至100 mL稀釋2倍的草莓汁，在30℃搖床（100 r/min）條件下培養(yǎng)24 h，使酵母液濃度達(dá)到1×109CFU/mL[11]。

接種：按照一定接種量接入活化酵母液。

草莓酒發(fā)酵：將處理完的果漿分裝至無(wú)菌三角瓶（300 mL/500 mL），在無(wú)菌條件下接入酵母活化液，充分混勻，用8層紗布封口，于25℃靜置發(fā)酵，每隔12 h搖瓶1次，第4天用發(fā)酵栓替換紗布，再靜置發(fā)酵9 d，當(dāng)發(fā)酵液無(wú)氣泡產(chǎn)生時(shí)終止發(fā)酵[12]，即得草莓酒。

1.3.2 接種量對(duì)草莓酒發(fā)酵性能的影響

以裂殖酵母為發(fā)酵菌株，分別采用不同接種量（3%、5%、7%、9%（V/V））進(jìn)行草莓酒發(fā)酵，并通過(guò)測(cè)定降糖速率、產(chǎn)酒精能力、產(chǎn)酸量及香氣成分含量，考察不同接種量對(duì)草莓酒發(fā)酵特性的影響。

1.3.3 分析檢測(cè)

還原糖含量測(cè)定采用斐林試劑滴定法[13]；可溶性固形物含量采用手持糖量折光儀直接測(cè)定法；pH值采用pH計(jì)直接測(cè)定法；滴定酸含量測(cè)定采用電位滴定法[13]；酒精和香氣成分含量測(cè)定采用氣相色譜法。

樣品預(yù)處理：取8層紗布過(guò)濾的酒樣20mL，和等體積去離子水一同常壓蒸餾，收集餾出組分35 mL，分別用15 mL、10 mL、10 mL二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，供氣相色譜測(cè)定香氣成分含量。

氣相色譜條件：采用FFAP石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32mm，0.5μm）；程序升溫：在40℃維持5min，再以15℃/min升至180℃；火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID），進(jìn)樣口溫度均為250℃；載氣為氮?dú)猓∟2），流量30mL/min，氫氣（H2）流量30 mL/min，空氣流量300 mL/min；分流比為1∶50；柱前壓為0.1 MPa；進(jìn)樣量為1 μL[10]。

定性定量方法：色譜峰保留時(shí)間是定性分析的依據(jù)，而色譜峰面積則是定量分析的依據(jù)。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)值表示為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。使用IBM SPSS Statistics19.0進(jìn)行顯著性差異分析，然后以P＜0.05的水平確定Duncan。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對(duì)草莓酒發(fā)酵還原糖和可溶性固形物含量的影響

圖1 不同接種量對(duì)草莓酒還原糖（A）及可溶性固形物（B）含量的影響Fig.1 Effects of different inoculum on reducing sugar(A)and soluble solids(B)content in strawberry wine

由圖1A可知，在不同接種量（3%～9%）的草莓酒發(fā)酵過(guò)程中，還原糖普遍處于下降狀態(tài)，發(fā)酵前8 d還原糖含量急劇下降，隨接種量增大，下降率依次為58%、68%、70%和70%；8～12 d還原糖含量下降較少，變化較平緩，下降率為29%、19%、13%和8%，表明主發(fā)酵基本完成。接種量在3%～9%范圍內(nèi)，還原糖消耗差異顯著（P＜0.05）；接種量越大，還原糖消耗越多越快，這是由于酵母接種量大則用于細(xì)胞大量生長(zhǎng)、繁殖以及代謝所消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)就更多[5，14]。由圖1B可知，可溶性固形物與還原糖含量具有相似的變化趨勢(shì)，發(fā)酵前8 d可溶性固形物含量急劇下降為11.3 g/L、10.7 g/L、10.2 g/L和10.1 g/L；8～12 d可溶性固形物含量下降較少，變化較平緩，隨接種量增大依次下降為10.0 g/L、9.1 g/L、9.3 g/L和9.5 g/L。從還原糖和可溶性固形物含量變化來(lái)看，7%和9%的接種量可以提高發(fā)酵前期還原糖消耗率，減少可溶性固形物含量。

2.2 接種量對(duì)草莓酒發(fā)酵pH值和滴定酸度的影響

圖2 不同接種量對(duì)草莓酒pH值（A）及滴定酸度（B）的影響Fig.2 Effects of different inoculum on pH(A)and titratable acidity(B)of strawberry wine

檸檬酸是草莓果實(shí)中的主要有機(jī)酸，約占總酸的80%[15]，適當(dāng)?shù)乃岷坎拍苁咕拼己瘛f(xié)調(diào)、適口。為了提高草莓酒的清爽適口感，可以在原料草莓制漿階段補(bǔ)加酒石酸等有機(jī)酸[16-17]。由圖2可知，發(fā)酵前2 d的pH下降，隨后一直升高；發(fā)酵前6天滴定酸度升高，隨后降低，在發(fā)酵后期又有所回升。在發(fā)酵2～6d以及8～12d期間，pH值和滴定酸度均升高，如發(fā)酵2～6d時(shí)，7%接種量的pH值由3.18升高至3.22，滴定酸度由7.76 g/L升高至8.62 g/L；發(fā)酵8～12 d，pH值由3.29升高至3.31，滴定酸度由8.28 g/L升高至8.31 g/L，這可能是代謝生成的有機(jī)酸解離度較低所致。發(fā)酵終點(diǎn)的滴定酸度和pH有顯著差異（P＜0.05），隨著接種量由5%增加至9%，滴定酸度降低，pH值升高。由于酵母菌生長(zhǎng)要消耗發(fā)酵體系中的氧氣，接種量越大，菌體生長(zhǎng)量越大，體系耗氧越多，剩余溶氧越少，酵母菌好氧代謝受到限制，也抑制了好氧醋酸菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致產(chǎn)酸量較低，pH值較高。3%、5%接種量的產(chǎn)酸量低，這可能是由于前者酵母菌數(shù)量少，糖代謝程度較低、速率較慢，生成醋酸的底物也較少導(dǎo)致的。從pH和滴定酸度變化來(lái)看，不同接種量有顯著差異（P＜0.05）；7%和9%的接種量能明顯降低草莓酒的滴定酸度，并提高pH值。

2.3 接種量對(duì)草莓酒發(fā)酵酒精含量的影響

圖3 不同接種量對(duì)草莓酒酒精含量的影響Fig.3 Effects of different inoculum on alcohol contents of strawberry wine

由圖3可知，接種量對(duì)草莓酒發(fā)酵過(guò)程的酒精生成及終濃度有顯著影響（P＜0.05）。7%接種量在第6天就進(jìn)入產(chǎn)酒精穩(wěn)定期，而3%和5%接種量在發(fā)酵第10天產(chǎn)酒精才接近穩(wěn)定，這說(shuō)明在一定范圍內(nèi)接種量越大，產(chǎn)酒精越快越多，越早進(jìn)入穩(wěn)定期。這是由于接種量較大，酵母細(xì)胞數(shù)量較多，發(fā)酵速度較快，能更快更多地利用糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化生成酒精。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，9%接種量遠(yuǎn)低于其他3個(gè)較低接種量的酒精產(chǎn)量，可能是接種量過(guò)大，酵母繁殖過(guò)快過(guò)多，耗糖量增大，而使用于生成酒精的糖分減少，最終減少酒精的產(chǎn)量。7%接種量酒精生成速率較快。

2.4 接種量對(duì)草莓酒發(fā)酵香氣成分含量的影響

根據(jù)文獻(xiàn)[18-20]報(bào)道和所試草莓酒的主要香氣成分的初步分析，本研究選定乙酸乙酯、丁酸乙酯、正丙醇、乙酸異戊酯、正丁醇、乳酸乙酯、異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇為草莓酒的主要香氣成分進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。

由表1可知，不同接種量發(fā)酵草莓酒的香氣成分含量中異戊醇、異丁醇和β-苯乙醇含量較高。在發(fā)酵前期（4 d），不同接種量發(fā)酵的各香氣成分含量之間差異較?。≒＞0.05）；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，香氣成分含量增加，在發(fā)酵8 d時(shí)各香氣成分含量約增加到發(fā)酵4d時(shí)各香氣成分含量的5倍；在發(fā)酵后期（12d），香氣成分含量呈現(xiàn)出較大差異（P＜0.05）。在發(fā)酵后期，隨著接種量的增大，丁酸乙酯和乙酸異戊酯含量升高；正丙醇、正丁醇和異丁醇含量降低；乙酸乙酯、乳酸乙酯和異戊醇含量先升高后降低，其中，在5%的接種量時(shí)乳酸乙酯含量最高，在7%的接種量時(shí)乙酸乙酯和異戊醇含量最高；而β-苯乙醇含量與接種量無(wú)明顯的相關(guān)性（R2=0.633）。在發(fā)酵后期，3%、5%、7%和9%接種量的草莓酒中4種酯類含量的總和依次分別為0.44 mg/L、0.66 mg/L、0.68 mg/L和0.60 mg/L，5種高級(jí)醇含量的總和依次分別為30.09 mg/L、39.65 mg/L、37.89 mg/L和38.70 mg/L。3%接種量的糖代謝速率最低，用于生成高級(jí)醇和酯類的前體物質(zhì)最少，酯類含量和高級(jí)醇含量明顯低于其他三種接種量。9%接種量，乙醇產(chǎn)量最低，由乙醇和?；o酶（coenzyme A，CoA）合成的乙酸乙酯和乳酸乙酯含量也較低。5%和7%的接種量發(fā)酵的草莓酒均具有較高的香氣質(zhì)量，經(jīng)人工品嘗，7%的接種量發(fā)酵的草莓酒更顯柔和、協(xié)調(diào)。

表1 不同接種量草莓酒香氣成分含量的影響Table 1 Effect of different inoculum on aroma components contents of strawberry wine

3 結(jié)論

不同接種量的草莓酒發(fā)酵特性明顯不同。在3%至7%范圍內(nèi)，接種量越大，降糖速率越快，產(chǎn)酸量越低，產(chǎn)酒精速度越快；當(dāng)接種量達(dá)到9%時(shí)，產(chǎn)酒精速度反而降低；5%和7%接種量的草莓酒在允許的范圍內(nèi)具有較高的酯和高級(jí)醇含量。接種量為7%的草莓酒發(fā)酵降糖速率較快，產(chǎn)酸量適中，產(chǎn)酒精速度最快，同時(shí)兼具較高的香氣質(zhì)量和柔和協(xié)調(diào)的口感。綜合分析，認(rèn)為7%接種量適宜草莓酒發(fā)酵。