泛素蛋白連接酶E3A在乳腺癌細胞中作用的蛋白質組學與生物信息學分析

謝少利，劉家有，王碧娟，黃紅梅，李靜佳，趙小波，鄧世山，侯令密

（1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院 甲狀腺乳腺外科，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學院解剖教研室，四川 南充 637000；3.川北醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 內科，四川 南充 637000）

三陰性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌分子分型中的一種特殊亞型，因其特殊的生物學特性，導致TNBC進展快、預后差成為其典型特點[1]。因為缺乏內分泌治療和靶向治療的特異位點，到目前為止，對TNBC的治療陷入瓶頸，臨床上尚無有效的綜合治療手段。蛋白質為生命功能的執(zhí)行者，在機體內其產生與降解維持著動態(tài)平衡。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)途徑（ubiquitin proteasome system，UPS）廣泛參與蛋白質的降解，因為特異性的泛素蛋白連接酶E3，導致其降解蛋白質具有高度選擇性[2]。泛素蛋白連接酶E3A（UBE3A）又稱E6-AP（E6 associated protein，E6-AP），屬于含有HECT結構的E3泛素蛋白連接酶家族成員，研究證實，細胞內大量的基因編碼的蛋白質如P53、c-myc、P27等可通過UBE3A介導的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。筆者在前期實驗[4-5]發(fā)現(xiàn)，通過慢病毒介導敲低UBE3A后，乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞的增殖能力降低、細胞的侵襲能力減低以及細胞周期發(fā)生明顯改變，提示UBE3A在乳腺癌細胞中扮演著重要角色，但其具體參與機制還不明確。本實驗對敲低UBE3A前后進行差異蛋白質分析，以檢測UBE3A前后TNBC細胞株MDA-MB-231細胞蛋白水平的表達差異，探討UBE3A敲低后乳腺癌細胞生物學行為改變的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

人TNBC細胞株MDA-MB-231，購于中國科學院細胞總庫。將MDA-MB-231細胞分為UBE3A敲低組與對照組，分別轉染shRNA-UBE3A片段與對細胞無影響的shRNA片段。

1.2 主要實驗儀器

倒置顯微鏡、熒光顯微鏡等購于德國Leica；酶標儀、SDS-PAGE電泳儀、轉膜儀、成像儀、PCR儀購于美國Bio-Rad；雙向電泳儀、掃描儀購于美國GE。

1.3 實驗主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國HyClone；目的片段、GV-115中國上海吉凱基因化學技術有限公司；脂質體Lipo-2000、Trans IT購于美國Invitrogen；逆轉錄試劑盒、PCR引物購于物美國Thermo；2-D clean-up kit、2-D Quant Kit、Immobiline DryStrip Cover Fluid、IPG Buffer pH 3-10 NL購于美國Pharmacia。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)及慢病毒感染常規(guī)方法培養(yǎng)MDA-MB-231以及用于包裝慢病毒的239T細胞；按上海吉凱基因提供的慢病毒包裝步驟包裝慢病毒載體并將其定量；待目的細胞融合度達到約30%～40%時，加入適宜量慢病毒，12 h后更換培養(yǎng)基；感染72 h后熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況，熒光率大于90%者，可用于后續(xù)實驗。

1.4.2 提取各組細胞總蛋白質及蛋白純化及定量取生長狀態(tài)良好的細胞，按蛋白提取試劑盒步驟常規(guī)提取各組細胞總蛋白；按GE提供的操作步驟進行純化及定量細胞總蛋白，確定后續(xù)實驗的準確性。

1.4.3 雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）第一向等點聚焦IEF：室溫平衡18 cm IPG預制干膠條至少15 min；取蛋白質樣品340 μL（約2.0 mg）進行上樣；將IPG干膠條膠面朝下置于水化盤中蛋白樣品溶液上；緩慢加入2 mL礦物油覆蓋IPG干膠條；按表1步設置等電聚焦程序進行IEF等點聚焦；結束后去除礦物油，取出膠條，加適當體積的SDS-DTT平衡緩沖液進行搖動平衡15 min；取出后再加入適當體積的SDS-碘乙酰胺平衡緩沖液再次搖動平衡15 min。第二向SDS-PAGE電泳：配制12%的丙烯酰胺凝膠后常規(guī)灌膠；取平衡后的膠條，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸，凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液，放置5 min使其凝固；在電泳槽加入電泳緩沖液后，起始時用的低電電壓，觀察溴酚藍指示劑，待指示劑在完全走出IPG膠條后，并濃縮成一條線后，再加大電壓，待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時，停止電泳。

表118 cm IPG膠條IEF程序設定Table 1 Protocol for IEF of 18 cm strip

1.4.4 差異蛋白質點選取電泳結束后取出凝膠，將膠放入考馬斯亮藍染色液中染色3 h；反復更換脫色液直至蛋白點明顯、背景清楚；置于掃描儀上掃描凝膠；利用PDQuest7.1軟件選取差異大于1倍以上的蛋白質點。

1.4.5 差異蛋白質點的串聯(lián)質譜檢測取切取的差異蛋白質點，-20℃冷凍保存，交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-TOF-MS/MS）檢測差異蛋白質。

1.4.6 差異蛋白點的生物信息學分析進入DAVID及Sting網址，對差異蛋白質進行GO分類，得到生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組分（cellular component，CC）各層面的相關生物學信息。

2 結 果

2.1 雙向電泳結果及差異蛋白質點生物信息分析

敲低UBE3A前后進行2-DE尋找差異蛋白質點，運用PD Quest 7.1軟件進行分析，選出28個差異蛋白質點（圖1）。選取28差異蛋白質點進行質譜分析，鑒定出差異表達蛋白質共28個，排除重復的后有24個蛋白質（表2）。本實驗最終得到28個差異蛋白質點，其中有實驗組有4個蛋白質相對陰性對照組高表達，有24個相對低表達。將其Map到DAVID數(shù)據(jù)庫中與Homo Species匹配的記錄有23個。對已識別的23個差異蛋白開展了進一步的分析。能夠進行生物學途徑、細胞成分、分子功能注釋分類的蛋白質分別為23個（100%）、20個（87%）和23個（100%）。差異性蛋白質在DAVID數(shù)據(jù)庫中按照GO的5個層次進行分析，每一層次有部分交叉，且部分概念分類內也有交叉。所以各分類的百分比之和可能超過100%。差異性蛋白質在KEGG數(shù)據(jù)庫的代謝和信號傳導通路涉及蛋白酶體、糖代謝等見表3。

2.2 String Tool分析差異蛋白質之間相互關系

本實驗中運用StringTool對鑒定的差異蛋白質進行相互作用預測，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白質中有23個蛋白質有著直接或者間接的聯(lián)系（圖2）。線越粗代表相互聯(lián)系越強。

圖12-DE圖片 A：對照組；B：UBE3A敲低組Figure 1 2-DE pictures A:Control group;B:UBE3A knock-down group

表2 差異蛋白質點信息Table 2 Information of the spots of differentially expressed proteins

表3 差異性蛋白質在KEGG數(shù)據(jù)庫的代謝和信號傳導通路Table 3 The metabolism and transduction pathways of the differentially expressed proteins in KEGG database

圖2 差異蛋白質相互關系Figure 2 Interactions of the differentially expressed proteins

3 討 論

蛋白質是生命功能的執(zhí)行者，機體蛋白質的產生與降解維持著動態(tài)平衡。其產生受基因調控，其降解主要通過兩種途徑，即溶酶體途徑和UPS，后者具有高度選擇性[2]。UPS由泛素（UB）、泛素活化酶E1、泛素結合酶E2、泛素蛋白連接酶E3、泛素延長酶E4、去泛素化酶DUB（DUB）和26S的蛋白酶體組成，在UPS中由于E3酶獨特的結構和功能域，決定了其介導的靶蛋白降解反應的高度選擇性與特異性[2]。UBE3A屬于含有HECT結構的E3泛素蛋白連接酶家族成員。目前的研究表明，UBE3A蛋白定位在細胞核中，作為甾醇類激素受體的共激活因子調節(jié)下游基因的轉錄參與天使綜合征（angelic syndrome，AS）[6-7]，研究證實，細胞內大量的基因編碼的蛋白質如P53、c-myc、P27等可通過UBE3A介導的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。蛋白質組學（proteomics）即是研究細胞、組織乃至生物體蛋白質組及蛋白質變化規(guī)律的學科，目前蛋白質組學研究首選的蛋白質分離技術仍是2-DE技術[8-9]。本次實驗將2-DE的差異蛋白點進行串聯(lián)質譜分析，能得到具體的蛋白質信息，將差異蛋白信息在DAVID以及String Tool在線數(shù)據(jù)庫進行生物信息學分析，以探討敲低UBE3A后乳腺癌細胞發(fā)生生物學行為改變的機制[10]，為后續(xù)的研究提供思路。

本實驗中2-DE凝膠圖譜選取差異表達蛋白質共28個，有4個蛋白質在UBE3A敲低組相對對照組高表達，24個相對低表達。鑒定結果中有4個相同的蛋白質。根據(jù)在2-DE凝膠圖譜及鑒定結果顯示位于不同的位置的部分蛋白質，但是質譜鑒定結果為同一種蛋白質，這可能是因為這些蛋白存在多種不同的翻譯后修飾形式，也有可能是部分多亞基蛋白被解離成單個亞基，或者部分蛋白質發(fā)生了共價鍵的解離，能夠改變蛋白的等電點及相對分子量，所以在雙向電泳圖譜上同一種蛋白質可能位于不同的位置。

將這24個差異蛋白質Map到DAVID數(shù)據(jù)庫中與Homo Species匹配的記錄有23個，剩余的1個可能因為還沒有完整的基因及蛋白功能注釋信息，因而不能識別。對已識別的23個差異蛋白開展了進一步的蛋白質的GO分析。能夠進行生物學途徑BP、細胞成分CC、分子功能MF注釋分類的蛋白質分別為23個（100%）、20個（87.7%）和23個（100%）。因這些差異性蛋白質在DAVID數(shù)據(jù)庫中按照GO的5個層次進行分析，每一層次有部分交叉，且部分概念分類內也有交叉，所以各分類的百分比之和會超過100%。同時在KEGG分析中顯示，在這些差異蛋白質中，PGK1、2集中參與了糖的有氧酵解和糖異生；蛋白酶體α亞基2、5及蛋白酶體β亞基4參與組成蛋白酶體，行使蛋白質的降解功能。

現(xiàn)今，在世界范圍內腫瘤與糖尿病是兩大主要的慢性疾病[11]，目前大部分研究表明糖代謝紊亂與惡性腫瘤息息相關[12-13]。大量的研究表明血糖的高水平或糖尿病能增加患乳腺癌的風險且增加乳腺癌患者的病死率[12,14-16]。PGK1是糖酵解過程中的關鍵酶之一，能夠將一個磷酸轉移到ADP上形成ATP[17]，此外，其還參與了多種生物學功能如腫瘤的血管生成[18]、DNA的復制與修復[19]。目前的研究表明PGK1與多種腫瘤相關如肝癌[19]、結腸癌[20]、胃癌[21]等。Sun等[22]最近的研究發(fā)現(xiàn)PGK1參與乳腺癌治療過程中耐紫杉醇，降低了乳腺癌的治療效果。在本實驗中也發(fā)現(xiàn)敲低UBE3A后PGK1表達減少，乳腺癌細胞浸潤與轉移能力也降低，所以猜想PGK1參與的糖酵解途徑發(fā)生的改變促使了UBE3A敲低后乳腺癌細胞的浸潤與轉移能力減弱。

降解蛋白質的UPS是一個依賴ATP高度有序的級聯(lián)酶促反應過程。在一系列酶的作用下將泛素標記的靶蛋白運送到26S的蛋白酶酶體上進行降解反應[23]。其中26S的蛋白酶體是一個由20S核心蛋白顆粒和2個19S調節(jié)顆粒構成的多亞基蛋白酶復合體。20S的核心是由7個相同的α亞基和7個相同的β亞基對稱排列構成的2個環(huán)形的桶狀結構組成，外部的α環(huán)圍繞著內部的β環(huán)，每個環(huán)各有7個相同的亞基，即為α1～α7和β1～β7[24]。Kondakova等[25]研究在人類多種腫瘤中26S蛋白酶體功能時發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體的降解功能與各亞基的含量不同有很大的關系。UBE3A作為UPS系統(tǒng)中關鍵酶之一，在本研究中發(fā)現(xiàn)，通過敲低UBE3A前后，參與組成蛋白酶體的α2、β4、α5亞基含量發(fā)生改變，其降解蛋白的功能也發(fā)生了改變，部分具有重要功能的蛋白質降解發(fā)生改變。因此，筆者認為在敲低UBE3A后乳腺癌的浸潤與增值能力降低可能就是蛋白酶體功能發(fā)生改變的結果。

為了解敲低UBE3A前后差異蛋白質之間相互作用關系，本研究利用String Tool蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫對這些差異蛋白質間的相互作用進行預測和分析，結果發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白質中，有23種蛋白質在蛋白質相互作用網絡圖上同時出現(xiàn)，說明這些蛋白質存在直接或間接的關系，線條越粗，關系越密切。可以推測這些差異蛋白質之間存在著某些功能聯(lián)系，且這些功能聯(lián)系與敲低UBE3A后乳腺癌細胞的增殖與浸潤能力有關。其中HSPA8、PSM、HYOU1、HNRNPA2B1、HMGB1、Annexin A2、HDGF、NME1關系較為緊密。這些蛋白質均與腫瘤的浸潤與轉移相關，這給予了很好的啟發(fā)，可選取這幾個蛋白用于乳腺癌的研究及下一步功能驗證。當然本實驗還有些許不足，這些差異蛋白質與UBE3A之間到底是什么關系，他們之間通過什么途徑相互作用還有待進一步的研究。這也為后續(xù)研究提供方向。

敲低UBE3A后，TNBC細胞株MDA-MB-231在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)功能與糖代謝功能方面發(fā)生變化，這可能是敲低UBE3A后乳腺癌細胞生物學行為改變的原因。當然這些差異蛋白質與UBE3A之間到底是什么關系，他們之間通過什么途徑相互作用還有待進一步的研究。