基于網(wǎng)絡藥理學探討丹梔逍遙散治療多囊卵巢綜合征的物質基礎及作用機制*

汪碧云，伍庭鳳，李舒婷，謝琳玲，曾 蕾

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學附屬中山中醫(yī)院，廣東 中山 528400；3.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡期女性中較常見的內分泌代謝紊亂性疾病，根據(jù)不同的診斷標準，約影響9%～18%的育齡期女性[1-2]。其主要表現(xiàn)為月經(jīng)失調、多毛、不孕等，常合并胰島素抵抗（IR）。PCOS發(fā)病機制目前尚不明確，涉及到遺傳、環(huán)境、精神心理因素等多個方面，可能為多因素共同作用的結果。目前對于PCOS的治療尚無特效藥物，多根據(jù)患者的具體情況個體化治療，包括調整月經(jīng)周期、促進生育、調整代謝等。由于PCOS缺乏特異性西藥治療，越來越多的學者關注中醫(yī)中藥對PCOS的防治。

中醫(yī)古籍沒有關于PCOS病名的記載，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸為“月經(jīng)過少”“月經(jīng)后期”“閉經(jīng)”“崩漏”以及“不孕”等范疇?，F(xiàn)代中醫(yī)各醫(yī)家對PCOS的治療略有差異，但其病機之本多責之于腎、肝、脾，緣此三臟功能失常，致沖任失調、痰壅胞宮、瘀血阻絡而發(fā)為本病。丹梔逍遙散原方出自明代薛己的《內科摘要》，其方根據(jù)《太平惠民和劑局方》中的逍遙散加減而來，具有疏肝清熱、養(yǎng)血健脾之功效，主治肝郁血虛內熱證。臨床多用于PCOS肝經(jīng)郁火證，該證型的患者多有高雄激素的表現(xiàn)。動物實驗證明該方能降低PCOS模型大鼠的抗米勒管激素（AMH）及雄激素（T）的水平，并能改善PCOS的IR情況[3-4]。但由于中藥復方藥物多且成分復雜，其具體的作用機制尚不明。因此需要系統(tǒng)地研究藥物、化合物、蛋白、基因及疾病的相互作用過程，以進一步明確該方的藥效物質基礎及作用機制。本研究基于網(wǎng)絡藥理學的方法，查找丹梔逍遙散的活性成分，并預測其作用靶點，通過建立藥物——疾病靶點的網(wǎng)絡圖，探索丹梔逍遙散治療PCOS的作用機制，為中藥復方的機制論證提供新思路。

1 材料與方法

1.1 丹梔逍遙散活性成分篩查 丹梔逍遙散的主要方藥組成包括牡丹皮、梔子、當歸、白芍、柴胡、茯苓、白術、甘草等，在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP[5]檢索上述各味中藥，得到相關活性化合物后，以藥物口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18為條件進一步篩選。將最終得到的活性成分導入化學信息數(shù)據(jù)庫Pubchem[6]，檢索各個活性成分的規(guī)范SMILES結構和化學結構式。

1.2 丹梔逍遙散潛在靶點的預測 將各活性成分的結構導入到Swiss Target Prediction[7]數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，預測其作用靶點，根據(jù)相關性的高低選取潛在作用靶點。

1.3 PCOS的相關靶點數(shù)據(jù)構建 疾病靶點的查詢基于人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards[8]，以“Polycystic O-vary Syndrome”為關鍵詞搜索。獲得相關靶點后，為便于數(shù)據(jù)分析，使用Uniprot[9]將靶點的Gene Symbol轉換成Uniprot ID。轉換完成后，繪制藥物-疾病靶點的Venn 圖（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），得到藥物作用的潛在靶點。

1.4 構建靶點-靶點相互作用（PPI）網(wǎng)絡圖 將丹梔逍遙散作用與PCOS的潛在靶點導入String數(shù)據(jù)庫構建PPI網(wǎng)絡，對于無相互作用的靶點予以剔除，將全節(jié)點關系信息導入到Cytoscape構建網(wǎng)絡圖，使用Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡圖，以Degree值大小對各靶點進行排序，取Degree＞10的核心靶點重新構建PPI圖。

1.5 靶點的信號通路分析和生物信息富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對核心靶點進行生物學過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）及細胞成分（cellular component，CC）的 GO 分析；并利用Cytoscape里的ClueGO聯(lián)合CluePedia插件進行KEGG分析。以此明確丹梔逍遙散治療PCOS的相關生物信息及調控通路。

2 結果

2.1 丹梔逍遙散活性成分篩查 在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索丹梔逍遙散各味中藥，共獲得1 081個活性成分，根據(jù)DL及OB進一步篩選后，最終得到162個活性成分，其中牡丹皮8個，柴胡16個，梔子15個，白芍12個，白術2個，茯苓15個，甘草92個，當歸2個。去除無化學結構式及未預測到靶點的活性成分，以及刪除重復項后，最終得到142個有效活性成分，構建藥物及活性成分網(wǎng)絡圖，其中粉色的節(jié)點為藥物共有的活性成分（如圖1所示）。

圖1 各個藥物的活性成分網(wǎng)絡圖（粉色為共有的活性成分）

2.2 潛在靶點預測 對活性成分進行靶點預測后得到483個靶點。在Gene Cards數(shù)據(jù)庫檢索到PCOS相關靶點共3 619個。在Uniprot數(shù)據(jù)庫中限定物種為人，由于客觀未知原因，最終疾病靶點有3 451個成功轉化ID。用Venn圖分析疾病與藥物靶點，得到140個藥物作用的潛在靶點。將潛在靶點導入String數(shù)據(jù)庫構建PPI網(wǎng)絡，將PPI網(wǎng)絡中全節(jié)點關系導入到Cytoscape，使用Network Analyzer對網(wǎng)絡進一步分析，將Degree≤10的節(jié)點剔除。對剩下的84個核心靶點進一步分析，得到網(wǎng)絡圖2。

2.3 丹梔逍遙散作用于PCOS的核心靶點的網(wǎng)絡分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對核心靶點進行GO分析，設置最小基因富集單位為2，以P＜0.05為有意義，最終得到 286個BP、81個MF和 34個CC。利用Cytoscape對其進行KEGG富集，設置Kappa score為0.4，最小富集單位為3，篩選P＜0.05的結果，最終得到83條通路，包括卵巢類固醇生成、磷脂酰肌醇3激酶 /蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路、IR信號通路、雌激素信號通路、子宮內膜癌等通路（圖3）。為進一步探索丹梔逍遙散治療PCOS的相關通路作用機制，通過KEGG中的KEGG Mapper，把核心靶點映射到相關通路中，最終得到多個通路圖，圖4為其中的一條卵巢類固醇激素生成通路圖，綠色標識為丹梔逍遙散的核心靶點。

3 討論

丹梔逍遙散為中醫(yī)古籍的經(jīng)典方劑，但和其他中醫(yī)方劑一樣，中藥成分的復雜性導致其難以解釋藥物治療疾病的具體作用機制。通過生物信息學構建藥物和疾病的互作網(wǎng)絡，整合藥物作用的靶點，對藥物的作用機制及開發(fā)有一定的指導意義。

圖2 藥物與疾病核心靶點交互作用的PPI網(wǎng)絡

圖3 Cytoscape中ClueGO對核心靶點富集出的KEGG通路圖

圖4 卵巢類固醇激素生成通路圖，綠色標識為本研究中的核心靶點

丹梔逍遙散作為治療PCOS常用的方劑之一，對于PCOS以高雄激素血癥為主要表現(xiàn)的患者有較好的治療效果，本研究運用網(wǎng)絡藥理學的方法探索本方療效的物質基礎和分子機制。

3.1 化合物作用靶點 目前已經(jīng)有關于本方中關鍵化合物對PCOS的作用機制研究。槲皮素（quercetin）是一種黃酮類化合物，為柴胡、梔子、牡丹皮及甘草的共有的化合物。已經(jīng)證明槲皮素可以促進肝臟己糖激酶（HK）和葡糖激酶（GK）活性，并降低 PCOS大鼠白介素 1β（IL-1β）、白介素 6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平，改善大鼠的胰島素抵抗（IR）狀態(tài)[10-11]。它還可以增加PCOS模型大鼠子宮的雌激素受體α（ERα）和葡萄糖轉運蛋白 4（GLUT4）基因的表達[11]，這可能是PCOS合并不孕的新的治療方向。同樣在人體也已經(jīng)證明口服槲皮素可以通過上調脂聯(lián)素受體和激活AMP激活蛋白激酶（AMPK）改善患者的IR狀態(tài)[12-13]。

芍藥苷（paeoniflorin）可以抑制大鼠卵巢睪酮的合成，并對刺激大鼠卵巢芳香酶活性以促進雌二醇合成[14]，還能促進脂肪細胞腺苷的釋放，激活腺苷A1受體，增加葡萄糖的攝取[15]。

黃芩苷（baicalin）可以通過抑制PCOS模型大鼠的卵巢HSD3B2基因表達，降低雄激素的生成[16]，還能上調葡萄糖轉運蛋白2（GLUT2）和GLUT4的表達，刺激肝細胞對細胞外葡萄糖濃度的瞬時響應和長期響應，對葡萄糖轉運進行精細調控，從而改善肝IR狀態(tài)[17]。

茯苓酸（pachymic acid）可以調節(jié)IL-6、TNF-α抑制PCOS的炎癥狀態(tài)，減少氧化應激，改善IR，減少卵巢顆粒細胞的凋亡，促進卵泡發(fā)育[18]。藏紅花酸（crocetin）作為一種天然類胡蘿卜素，能改善肥胖誘導的IR[19]，還可以調節(jié)PCOS小鼠的動情周期，恢復其紊亂的激素水平，從而促進排卵[20]。

以上各類化合物以及其他山柰（kaempferol）、柚皮素（naringenin）等均能通過不同的途徑改善PCOS的高雄激素血癥/IR/低度炎癥情況，體現(xiàn)了丹梔逍遙散治療PCOS多成分、多靶點的特點。

3.2 核心靶點的富集分析 對核心靶點的GO富集分析提示丹梔逍遙散作用于PCOS可能與甾體激素合成、細胞增殖、氧化還原等多個BP過程有關。MF層分析其涉及到酪氨酸激酶、類固醇激素、ATP等；CC層面分析提示其涉及到細胞膜、內質網(wǎng)膜、細胞質、受體復合物及膜筏等多細胞成分。

在對核心靶點的KEGG富集分析中，進一步體現(xiàn)了丹梔逍遙散通過多個通路對PCOS產(chǎn)生作用，包括氧化應激、激素合成、代謝等多個方面，涉及到PI3K/Akt、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、甾體激素合成及胰島素等多個信號通路。

IR作為PCOS病機的關鍵之一，不僅存在于PCOS患者的外周組織中，同時也表達于卵巢及子宮內膜局部，降低患者的受孕機率并增加流產(chǎn)風險。胰島素信號傳導通路主要有2條，一條為PI3K/Akt途徑。當胰島素與胰島素受體結合，促進胰島素受體底物（IRS）磷酸化，進而激活PI3K，生成第二信使PIP3，激活下游的Akt，調節(jié)糖代謝。PCOS患者的胰島素受體底物-1（IRS-1）介導的PI3K活性下降以及葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）減少，造成IR狀態(tài)[21]。同時，PCOS-IR患者的胰島素可能通過PI3K/Akt通路促進子宮內膜的異常增生[22]。另一條為絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節(jié)激酶（MAPK/ERK）促有絲分裂通路。當PCOS-IR時，2條信號通路失衡，MAPK/ERK活化，導致PI3K/Akt信號通路缺陷，可以進一步促進IR 形成[23]。

目前的研究已經(jīng)證實PCOS患者存在代謝性炎癥狀態(tài)，且其代謝性炎癥可進一步促進患者的代謝紊亂。而PI3K/Akt通路不僅與PCOS的胰島素代謝有關，還與PCOS患者的炎癥及氧化應激狀態(tài)相關，Zhao等人[24]利用特異性抑制劑探索 NF-κB、Akt、JNK、Erk1/2等通路，發(fā)現(xiàn)WNT5a主要依賴于PI3K/Akt/NF-κB信號通路誘導PCOS患者的炎癥及氧化應激。

高雄激素血癥表現(xiàn)的痤瘡、脫發(fā)、油脂分泌旺盛等中醫(yī)多辨證為肝郁化火，治以丹梔逍遙散多有療效。已用實驗證明丹梔逍遙散能降低PCOS瘦素水平，抑制AMH分泌等，從而改善高雄激素血癥[3，25]。另外根據(jù)關鍵靶點的KEGG通路圖所知（如圖4所示），丹梔逍遙散降雄的機理可能與 CYP17、CYP19A1、CYP1B1、17β-HSD 等有關。CYP17主要調節(jié)17α-羥化酶和17，20-裂解酶活性，為雄激素合成的關鍵酶。PCOS患者的17α-羥化酶活性增加而17，20-裂解酶活性下降，致使兩者活性失調從而引起雄激素合成增加[26]。CYP17可能為丹梔逍遙散作用的重要靶點之一，具體需待進一步實驗認證。

綜上所述，網(wǎng)絡藥理學結果提示丹梔逍遙散在治療PCOS上共涉及到142個活性成分、84個核心靶點，其作用機制包括甾體激素合成、氧化還原等，涉及到卵巢類固醇生成、PI3K/Akt、IR等多個信號通路，體現(xiàn)了中藥治療疾病的多中心、多靶點、多途徑的作用特點。本研究涉及到的部分靶點及分子機制已被相關研究證實，另有一部分挖掘出的靶點及相關通路可作為下一步研究的理論基礎，為丹梔逍遙散的作用機制的進一步研究提供方向。