Box-Behnken中心組合設計優(yōu)化復合奶酒發(fā)酵工藝

江宇琪，王琪，劉琨毅，趙金松，吳冬梅

(1.宜賓職業(yè)技術學院五糧液技術學院，四川宜賓644003；2.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；3.瀘州職業(yè)技術學院白酒學院，四川瀘州646005)

0 引 言

目前，市面上大部分的乳酒都是以馬奶或羊奶為原料，以開菲爾?；蚪湍妇c乳酸菌的混合菌為發(fā)酵劑，但存在酸度普遍偏高的不良特性[1-8]。利用大豆制得的豆?jié){與馬奶或羊奶相比，含有較為豐富的植物蛋白質及營養(yǎng)物質，是馬奶或羊奶理想的替代品，也是近年來研究的熱點[9-11]。豆?jié){酒作為一種含有酒精的復合飲料，與傳統(tǒng)的乳酒相比，其特點是含有豐富的植物蛋白和豆乳的其他營養(yǎng)成分，既補充了我國居民因牛乳等動物蛋白攝入不足的缺陷，又比傳統(tǒng)的乳酒口感更加柔和[12-14]。雖然豆?jié){酒酒體風味獨特、口感柔和，但是其香味不夠豐滿濃郁進而影響豆?jié){酒整體的感官特性[14－15]。

復合型發(fā)酵酒是使用兩種或兩種以上的釀酒原料發(fā)酵而成的酒品，其能綜合兩種或兩種以上原料的特點與優(yōu)勢，彌補利用單一原料釀酒在色、香、味上的欠缺和營養(yǎng)成分不足等缺陷[16－17]。因此，本試驗采用牛奶與豆?jié){混合發(fā)酵釀造，通過優(yōu)化其發(fā)酵工藝條件，以期釀出的酒體風味優(yōu)雅、口感幼滑、酸度適中的復合奶酒，為后續(xù)工業(yè)化生產提供一定的理論基礎。

1 實驗

1.1 材料與試劑

釀酒酵母，大豆、牛奶、白砂糖，冰乙酸（分析純），乙酸鈉（分析純），檸檬酸（分析純），氫氧化鈉（分析純），亞硫酸鈉（分析純），硫酸銅（分析純），酒石酸鉀鈉（分析純），次甲基藍。

1.2 儀器與設備

豆?jié){機（JYL-C91T型），超凈工作臺（SW-CJ-2FD型），電子天平（FA20043型），低速大容量多管離心機（LXJ-IIB型），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（MC-GNP-9080型），不銹鋼手提式滅菌器（DSX-280A型），電冰箱（BCD-2HBSA型），精密pH計（PHs-3c型），酒精度測試儀（AT6000型）。

1.3 復合奶酒釀造工藝流程

復合奶酒釀造工藝流程為

操作要點：挑選顆粒成熟飽滿的大豆，去除其中的雜質，清水洗凈后用5倍質量的清水浸泡9~12 h；將浸泡好的大豆按1∶10的質量比加水磨漿后根據單因素試驗及響應面試驗的條件添加牛奶并煮沸，添加不同濃度的白砂糖并用檸檬酸溶液調pH值到5.0后添加0.02%的亞硫酸鈉，以抑制雜菌的生長；在無菌條件下接入一定量的經活化后的酵母菌懸液，25℃發(fā)酵，待發(fā)酵完成后置于4℃的冰箱中后熟24 h。

1.4 方法

1.4.1 理化指標測定方法

總糖（以葡萄糖計）測定采用斐林試劑法[18]，酒精體積分數測定采用密度瓶法[18]，總酸測定采用電位滴定法[18]，氨基酸態(tài)氮測定采用甲醛滴定法[18]。

1.4.2 感官評價

感官評價在學院食品品評室內完成，邀請13位教師及實驗員組成評定小組，明確感官評定的指標和注意事項。參照王璐等人對馬奶酒發(fā)酵條件的研究[6]、符楨華等人對豆?jié){酒的研究方法[13]及GB/T 2354-2009標準[18]對復合奶酒從色澤（滿分5分）、組織形態(tài)（滿分5分）、香氣（滿分30分）、滋味（滿分40分）、典型性（滿分20分）5個方面制定復合奶酒感官評價標準，如表1所示。

1.4.3 單因素實驗

白砂糖添加量對復合奶酒發(fā)酵效果的影響：將豆?jié){與牛奶按照1∶1的體積比混合后煮沸，分別加入6%，12%，10%，12%，14%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，待冷卻后接入0.3%經活化后的酵母菌，25℃發(fā)酵5 d后分別記錄復合奶酒的感官特征，以確定較佳的白砂糖添加量。

物料比對復合奶酒發(fā)酵效果的影響：將豆?jié){與牛奶分別按照3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3的體積比混合后煮沸，并添加質量分數為10%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，待冷卻后接入質量分數為0.3%經活化后的酵母菌，25℃發(fā)酵5 d后進行感官評價，以確定較佳的物料比。

表1 復合奶酒評分細則

接種量對復合奶酒發(fā)酵效果的影響：將豆?jié){與牛奶按照1∶1的體積比混合后煮沸，并添加質量分數為10%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，待冷卻后分別接入質量分數為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%經活化后的酵母菌，25℃發(fā)酵5 d后分別進行感官評價，以確定較佳的酵母菌接種量。

發(fā)酵時間對復合奶酒發(fā)酵效果的影響：將豆?jié){與牛奶按照1∶1的體積比混合后煮沸，并添加質量分數為10%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，待冷卻后接入質量分數為0.3%經活化后的酵母菌，在25℃的條件下分別發(fā)酵3，4，5，6，7 d并進行感官評價，以確定較佳的發(fā)酵時間。

1.4.4 響應面優(yōu)化實驗

在單因素實驗的基礎上，根據Box-Benhnken[19]的中心組合試驗設計原理，進行四因素三水平的響應面分析實驗，確定復合奶酒最佳的釀造工藝條件，因素水平如表2所示。

1.5 數據分析處理方法

以上每個試驗重復3次，結果取平均值。采用OriginPro 9.1軟件進行數據制圖和統(tǒng)計分析。Design Expert 8.0.6軟件進行響應面設計及結果分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 白砂糖添加量對復合奶酒感官評分的影響

控制處理條件為物料比（豆?jié){∶牛奶）1∶1（體積比）、接種量0.3%、發(fā)酵時間5 d，考察在白砂糖添加量質量分數分別為6%，8%，10%，12%，14%時復合奶酒的感官評分，結果如圖1所示。

圖1 白砂糖添加量對復合奶酒感官評分的影響

圖1中，不相同字母表示差異顯著（P<0.05），下同。由圖1可以看出，當復合奶酒中白砂糖添加量從6%增加到10%，復合奶酒的感官評分也隨之增加；當添加量達到10%時，復合奶酒的感官評分達到最高分（76.25±0.87）分。但隨著白砂糖添加量的繼續(xù)增加，復合奶酒的感官評分開始呈現出逐漸下降的趨勢?？砂l(fā)酵性糖在復合奶酒發(fā)酵過程中主要轉化為乙醇，也可以轉化成酸類、酯類、醛類等物質[14]。復合奶酒在發(fā)酵過程中，可發(fā)酵性糖偏少會出現酒體不豐滿、香味不足的現象，而可發(fā)酵性糖過多則會造成酒體酸度偏大等不良現象。故選用白砂糖添加量為8%，10%及12%用于后續(xù)響應面法實驗。

2.1.2 物料比對復合奶酒感官評分的影響

由圖2可以看出，豆?jié){能顯著改善牛奶酒的風味特征，不僅能有效降低牛奶酒的酸度，而且能賦予牛奶酒獨特的風味。復合奶酒的感官評分隨著復合奶酒原料中牛奶比例的增加而呈現出先增高后降低的趨勢，當物料比（豆?jié){∶牛奶）為1∶2（體積比）時，復合奶酒的感官評分達到最高的（83.52±0.77）分。因豆?jié){比例過大會造成復合奶酒香味較寡淡、豆腥味突出等不良特征，豆?jié){比例偏低又會使復合奶酒出現較高的酸度，因此當豆?jié){與牛奶比例適當時才能賦予復合奶酒特殊的風味及克服奶酒與豆?jié){酒的缺陷。由此選擇物料比（豆?jié){∶牛奶）為1∶1，1∶2，1∶3作為后續(xù)響應面實驗的因素水平。

2.1.3 接種量對復合奶酒感官評分的影響

由圖3可以看出，隨著酵母菌接種量的不斷增加，復合奶酒的感官評分也隨之不斷增加。當酵母菌接種量為0.5%時，復合奶酒的感官評分達到最高的（76.68±1.04）分。酵母菌在發(fā)酵過程中能將可發(fā)酵性糖轉化為二氧化碳和乙醇，同時還會產生其他一些醇、醛、酸、酯等香味物質[13]。當酵母菌接種量偏低時，容易使釀酒原料不能完全發(fā)酵，造成復合奶酒酒度偏低、酒香不突出等現象。當酵母菌的接種量為0.3%與0.4%時，其復合奶酒的感官評分雖然較酵母菌接種量為0.5%時低，但三者并無顯著性差異（P>0.05）。所以選擇酵母菌接種量為0.2%~0.4%用于響應面法試驗。

圖2 物料比對復合奶酒感官評分的影響

圖3 接種量對復合奶酒感官評分的影響

2.1.4 發(fā)酵時間對復合奶酒感官評分的影響

控制處理條件：白砂糖添加量質量分數10%、物料比（豆?jié){∶牛奶）1∶1（體積比）、接種量0.3%，分別考察發(fā)酵時間為3，4，5，6，7 d時復合奶酒的感官評分，結果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵時間對復合奶酒感官評分的影響

由圖4可以看出，復合奶酒的感官評分隨著發(fā)酵時間的延長而增加，當發(fā)酵時間為7 d時，復合奶酒的感官評分達到最高的（83.11±0.67）分。雖然復合奶酒的感官評分在其發(fā)酵6 d時較發(fā)酵7 d時偏低，但二者并無顯著性差異（P>0.05）。當發(fā)酵時間少于5 d時，醪液中的可發(fā)酵性糖還未完全被酵母菌所利用，酒體略顯寡淡，乙酸乙酯等酒香物質含量偏低，使得復合奶酒的酒香不夠濃郁。因此選擇發(fā)酵時間為5，6，7 d用于后續(xù)試驗。

2.2 響應面法實驗

根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，通過Design Expert 8.0.6軟件設計響應面法試驗，對白砂糖添加量、物料比（豆?jié){∶牛奶）、接種量、發(fā)酵時間4個因素分析得到以下試驗方案及結果如表3所示。

表3 響應面試驗設計及結果

再通過Design-Expert 8.0.6軟件對響應面法試驗得到的感官評分（見表3）進行方差分析，得到結果如表4所示。

由表4可以看出，4個因素對復合奶酒感官評分影響的強弱順序依次為：接種量>發(fā)酵時間>物料比>白砂糖添加量，其中接種量對復合奶酒感官評分的影響顯著（P<0.05）。物料比與接種量之間具有極為顯著的交互作用（P<0.01）。設白砂糖添加量、物料比、接種量、發(fā)酵時間分別為A，B，C，D；以復合奶酒的感官評分為響應值，經多元回歸擬合后，得到復合奶酒感官評分回歸方程：復合奶酒感官評分=82.33-0.35A+0.46B-0.98C+0.62D+0.33AB+0.43AC-0.94AD+2.82BC+1.41BD-0.067CD-3.12A2-2.50B2-3.29C2-4.17D2。

根據表4中方差分析結果，復合奶酒感官評分的回歸方程描述與響應面值之間的關系模型顯著（P<0.05），且失擬項檢驗不顯著（P>0.05），表明未知因素對實驗結果的干擾較小，該試驗模型充分擬合試驗數據，復合奶酒感官評分的回歸方程是復合奶酒感官評分與復合奶酒發(fā)酵工藝各參數的合適數學模型，即可以利用此回歸方程確定復合奶酒釀造的最佳工藝[20]。

表4 方差分析

響應面圖形是響應值對各試驗因子所構成的三維空間的曲面圖，從響應面分析圖上可形象地看出最佳參數及各參數之間的相互作用[21]。根據復合奶酒感官評分回歸方程得出不同因子的響應面分析圖結果如圖5所示。

由響應面圖曲面坡度越陡峭、等高線越密集成橢圓形表示兩因素交互影響越大的原則[20-22]可知，因子B（物料比）與因子C（接種量）之間所形成的響應面曲面坡度在兩因素交互作用響應面圖中最為陡峭即因子B與因子C相互之間具有最強的交互作用。該結果與表4方差分析所得的物料比與接種量之間具有極為顯著的交互作用（P<0.01）的結論相吻合。

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析確定復合奶酒的最佳發(fā)酵工藝條件為白砂糖添加量9.84%、物料比（豆?jié){：牛奶）1∶2.04（體積比）、接種量0.29%及發(fā)酵時間6.09 d，此條件下由公式算出的理論值為86.32分。根據所得的分析數據進行3組驗證試驗，驗證試驗的條件為白砂糖添加量9.8%、物料比（豆?jié){∶牛奶）1∶2（體積比）、接種量0.3%及發(fā)酵時間6.1 d，得到復合奶酒的感官評分為（86.07±1.04）分，測定結果穩(wěn)定，偏差不大，證明該結果合理可靠。

2.3 理化指標分析

經測得復合奶酒在最佳發(fā)酵工藝條件下的總糖為11.6 g/L、酒精體積分數5.3%，總酸質量濃度7.9 g/L，氨基酸態(tài)氮質量濃度0.24 g/L。4種理化指標均符合中華人民共和國GB/T 2354-2009標準[18]。

圖5 兩因素交互作用對感官評分的響應面

3 結 論

在單因素實驗的基礎上采用響應面法對復合奶酒的發(fā)酵工藝條件進行了優(yōu)化，影響復合奶酒感官評分的工藝因素按主次順序排列為接種量>發(fā)酵時間>物料比>白砂糖添加量。最終確定了其最優(yōu)工藝條件為：將浸泡好的大豆按1∶10的質量比加水磨漿后按照物料比（豆?jié){：牛奶）1∶2（體積比）加入牛奶煮沸，加入質量分數為9.8%的白砂糖并用檸檬酸溶液調pH值到5.0后添加0.02%的亞硫酸鈉，在無菌環(huán)境條件下接入0.3%經活化后的酵母菌懸液，在25℃條件下發(fā)酵6.1 d后置于4℃的冰箱中后熟24 h。此條件下可獲得色澤微黃透明、奶香與酒香和諧、酒體豐滿圓潤的復合奶酒，其感官評分為86.07分。若需將此復合奶酒進行工業(yè)化生產還需對酒體進一步勾調及澄清處理，使其感官特性符合商品要求。