干酪中的生物活性肽及其作用

焦晶凱，劉振民，蘇米亞，鄭遠(yuǎn)榮，劉景

（乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海200436）

0 引 言

人們通常所說(shuō)的干酪是使用凝乳酶、菌種、熱酸化的一種或幾種方法將牛奶凝乳形成，干酪也可以稱作奶酪。世界上的干酪可以根據(jù)牛乳來(lái)源、制作工藝、脂肪含量、發(fā)酵類型和所含菌種進(jìn)行分類，其種類可以分為上千種[1]。

干酪生物活性肽在干酪成熟過(guò)程中產(chǎn)生，在這一過(guò)程中，牛乳中的各種蛋白酶、凝乳酶和LAB代謝酶類發(fā)揮重要作用，從而不斷的合成釋放多肽，其種類和數(shù)量受蛋白水解因素的影響，如pH值，酶的類型，鹽水比，濕度，儲(chǔ)存時(shí)間和溫度[2-3]，因此不同品種的干酪會(huì)產(chǎn)出不同生物活性的多肽，例如抗高血壓，抗氧化，抗增殖等活性，本文主要針對(duì)以上幾個(gè)類型的干酪活性肽就目前的研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

1 抗高血壓肽

在發(fā)達(dá)國(guó)家，高血壓是影響多達(dá)30%成年人的慢性病，并可能誘發(fā)并發(fā)癥，如中風(fēng)和冠心病。在人類系統(tǒng)中，其中控制血壓的一種生理途徑是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)。該系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分是血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶（ACE），它可以催化血管緊張素I向血管收縮劑血管緊張素II轉(zhuǎn)化，并同時(shí)降解血管擴(kuò)張劑緩激肽和胰激肽。這兩個(gè)反應(yīng)導(dǎo)致血管收縮和醛固酮釋放，增加鈉濃度和血壓。因此，抑制這種酶可以起到降壓作用。世界大多數(shù)高血壓患者在接受治療時(shí)使用ACE抑制藥物如卡托普利或依那普利。隨著牛奶發(fā)酵和成熟過(guò)程中釋放的多肽序列鑒定，干酪已被廣泛作為ACE抑制劑的潛在來(lái)源。表1為部分干酪的水溶性和/或乙醇溶性提取物（WSE，ESE）及其相應(yīng)的ACE抑制活性。有學(xué)者鑒定了來(lái)自Roquefort-type干酪的多肽,序列為YQGPIVLNPWDQVKR，與αS2酪蛋白具有相似序列，此干酪表現(xiàn)了較強(qiáng)ACE抑制活性[4]。一些含有VPP和IPP序列的多肽具有ACE-抑制活性，有學(xué)者在布里干酪（Brie）、切達(dá)干酪（Cheddar）、艾達(dá)姆干酪（Edam）、高達(dá)干酪（Gouda）、戈?duì)栘曌衾℅orgonzola）和格魯耶爾（Gruyere）及其他一些干酪中發(fā)現(xiàn)了序列為VPP和IPP的抗高血壓β-酪蛋白肽[5-6]。Stuknytè等人[5]也在不同干酪如布里干酪（Brie）、切達(dá)干酪（Cheddar）、戈?duì)栘曌衾℅orgonzola）和馬斯丹（Maasdam）等干酪中鑒定了酪蛋白水解產(chǎn)物中含有抗高血壓αs1-酪蛋白衍生肽AYFYPEL和RYLGY。雖然在一些干酪提取物中發(fā)現(xiàn)ACE抑制活性肽及一些抗高血壓肽的存在，但仍需進(jìn)一步在動(dòng)物模型中證實(shí)干酪的抗高血壓作用。

表1 部分干酪中血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制活性及鑒定作用多肽

2 抗氧化肽

由于活性氧產(chǎn)生增加引起（ROS）的氧化應(yīng)激，會(huì)引起細(xì)胞的抗氧化能力下，進(jìn)而會(huì)引發(fā)一系列人類疾病，包括心血管疾病，代謝疾病，炎癥，神經(jīng)退行性疾病和癌癥并且加速老化過(guò)程。天然抗氧化劑可以對(duì)氧化應(yīng)激進(jìn)行內(nèi)源性抵抗，食物中所含有的肽是天然的抗氧化劑，沒(méi)有嚴(yán)重的副作用。其中，牛奶蛋白質(zhì)是最重要的天然肽來(lái)源之一[10-11]。

有學(xué)者測(cè)定了巴爾米賈諾雷吉亞諾（Parmigiano-Reggiano）干酪水溶性多肽提取物的自由基清除活性，其抗氧化活性完全不受成熟時(shí)間和胃腸消化的影響[12]。Meister Meira等人[5]測(cè)定了巴西的菲達(dá)干酪（Fata）、洛克福干酪（Roquefort-type）和羊乳干酪（Pecorino-type）的水溶性提取物抗氧化活性，結(jié)果顯示菲達(dá)干酪、洛克福干酪的ABTS清除自由基能力分別是32%~45%和87%。Roquefort-type干酪的DPPH自由基清除活性最強(qiáng)，其序列與以前表征過(guò)具有抗氧化活性的肽有很高的同源性。最近，在布爾戈斯型（Burgostype）干酪中鑒定出三種來(lái)源于αs1-和β-酪蛋白的肽。其中一種同源于αs1-酪蛋白（SDIPNPIGSENSEKTTPLLW），是一種新的肽，具有潛在的抗氧化活性[13]。這些結(jié)果表明干酪是抗氧化肽的良好來(lái)源，但仍需動(dòng)物模型和人體試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 神經(jīng)肽

類阿片藥物肽是一類具有興奮劑和拮抗作用的阿片μ-受體配體。研究得最多的乳源阿片受體配體是由β-酪蛋白衍生的一類肽，稱為β-酪啡肽（BCM）。除了對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響之外，BCMs已被證明能夠誘導(dǎo)腸粘液分泌、增加血漿胰島素水平、降低胰高血糖素水平、并提高超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性[14-15]。UIHaq等人[16]還找到了BCMs的其他一些益生作用。

Sienkiewicz-Szlapka等人[17]測(cè)定了三個(gè)半硬質(zhì)干酪（艾達(dá)姆Edamski、高達(dá)Gouda和卡斯特蘭Kasztelan）以及兩種成熟霉菌干酪（布里Brie和羅克波爾Rokpol）中的類阿片肽含量，包括具有興奮劑作用BCM7和BCM5、拮抗作用的casoxin-6和casoxin-C（衍生自牛κ-酪蛋白）和乳鐵蛋白A（衍生自乳鐵蛋白）的含量。發(fā)現(xiàn)霉菌干酪中BCMs的含量高于半硬干酪，它含有相當(dāng)高的casoxin-6。除Gouda外，所有其他干酪提取物都被發(fā)現(xiàn)能夠影響分離的兔回腸的腸動(dòng)力，類似于嗎啡作用。類似的，DeNoni和Cataneo[18]測(cè)定了戈?duì)栘曌衾璆orgonzola、山羊干酪Caprino,、布里 Brie、意大利 Taleggio、高達(dá) Gouda、芳提娜Fontina、切達(dá)Cheddar和格拉納帕達(dá)諾GranaPadano干酪及其消化產(chǎn)物中BCMs含量，除了Taleggio、Caprino和GranaPadano干酪，均檢測(cè)出BCM7。隨后Toelstede等人[19]也證實(shí)在成熟的Gouda奶酪的WSE中存在BCM10（β-酪蛋白（60-69））。在意大利山羊干酪CaprinodePiemonte的WSE中也發(fā)現(xiàn)BCM9[20]。

關(guān)于類阿片藥物肽的實(shí)際生物利用度研究較少，僅在喂食2周和4周齡含酪蛋白配方食物的小鼠血漿中檢測(cè)到BCM[21]。在喂食母乳和牛乳的嬰兒血漿中檢測(cè)到了具有免疫反應(yīng)性的BCMs[22]。有必要繼續(xù)探索BCMs在人類健康中的作用，以及應(yīng)用改進(jìn)的診斷技術(shù)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。此外，還需要更多的研究來(lái)評(píng)估這些肽在復(fù)雜的食物基質(zhì)中的吸收程度。

4 抗增殖肽

已經(jīng)有一些體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究了牛奶蛋白（如乳鐵蛋白和乳鐵蛋白）具有抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)能力，主要作用是在腫瘤生長(zhǎng)中充當(dāng)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。然而，相應(yīng)抗增殖特性的肽序列并沒(méi)有鑒定出來(lái)。截至目前，有研究驗(yàn)證了干酪提取物具有抗增殖作用，但所有描述的結(jié)果都基于干酪提取物或干酪乳清，并非干酪本身。Yasuda等人[23]驗(yàn)證了12種商業(yè)干酪提取物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和HL-60人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中誘導(dǎo)DNA斷裂中起到的作用。其中蒙塔格納德干酪Montagnard，蓬萊韋克干酪Pont-l'Eveque，布里干酪Brie，卡門(mén)貝爾干酪Camembert，丹麥藍(lán)紋Danablue和藍(lán)紋干酪Bluecheese提取物具有最高的抗增值活性。還指出，不同干酪成熟度與它們的抗增殖活性之間呈正相關(guān)。

有學(xué)者研究馬蘇里拉干酪的乳清樣品可以減少43%的Caco2細(xì)胞的增殖。從原奶中提取的多肽并沒(méi)有這種作用，說(shuō)明特定的生物活性物質(zhì)是在干酪的生產(chǎn)過(guò)程中釋放的[24]。隨后，該學(xué)者使用RP-HPLC純化多肽片段，并使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜MALDI-TOF/MS進(jìn)一步鑒定這些活性多肽，大多是由κ-酪蛋白肽和β-酪蛋白衍生而來(lái)[25]。

5 抗菌肽

迄今為止，幾乎所有公開(kāi)發(fā)表出版物涉及的干酪的抗菌特性都是基于水溶性多肽提取物質(zhì)WSE的，而且很少有鑒定其中的功能性多肽序列。Théolier等人[26]測(cè)定了來(lái)自五種商業(yè)奶酪（莫扎里拉干酪，高達(dá)干酪，瑞士干酪，以及中度和重度成熟的切達(dá)干酪）的WSE的抗菌活性，在通過(guò)Sep-Pakclean柱分離以前，莫扎里拉和高達(dá)干酪的WSE可以抑制高達(dá)4.66個(gè)對(duì)數(shù)周期的李斯特菌ListeriaivanoviiHPB28、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ScottA3、大腸桿菌MC4100和大腸桿菌O157：H7。但是，在脫鹽后，幾乎沒(méi)有抗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ScottA3和大腸桿菌O157：H7的活性，這就難以說(shuō)明抗菌性來(lái)自干酪的WSE還是其中的有機(jī)酸或鹽，該研究凸顯了在測(cè)定干酪的WSE活性之前，純化步驟的重要性。莫扎里拉、高達(dá)和瑞士干酪脫鹽后的WSE可以誘導(dǎo)幾種食源性霉菌的孢子萌發(fā)延遲。此外，還有學(xué)者[27]研究了阿西雅格干酪Asiagod'Allevo純化后的WSE活性，表現(xiàn)出對(duì)威爾斯李斯特菌L.innocuaLRGIA01有一定的抗菌性能。埃門(mén)塔爾干酪EmmentaldeSavoie純化的WSE也被證實(shí)具有抗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌株162的活性[28]。雖然迄今為止，沒(méi)有公開(kāi)發(fā)表的體內(nèi)研究數(shù)據(jù)直接表明食用干酪具有抗菌影響。但是，一些干酪提取物被證實(shí)確有一定的抗菌作用。

6 礦物質(zhì)吸收的調(diào)節(jié)肽（磷酸肽）

磷酸肽CPPs是具有不同程度磷酸化的生物活性肽，它通過(guò)體外和體內(nèi)釋放的酶不同程度的水解酪蛋白形成的。因?yàn)檫@些肽具有較高凈負(fù)電荷，它們可以有效地結(jié)合二價(jià)陽(yáng)離子形成可溶性復(fù)合物。因此磷酸肽是防齲的有效物質(zhì)。除了具有金屬螯合性能外，CPP還具有其他生物活性，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、胃分泌調(diào)節(jié)、抗菌劑以及對(duì)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的刺激活性[29-30]。

近年來(lái)，一些研究已經(jīng)從不同類型干酪中分離、表征和鑒定了CPPs。通過(guò)分析總的WSE和濃縮沉淀的方法分析驗(yàn)證CPPs的存在。盡管許多干酪品種中的酶是共通的，但是不同干酪的肽組份都是獨(dú)特的，并且受到成熟過(guò)程的影響。在Comté干酪中，β-和αs2-酪蛋白的原始切割歸因于纖溶酶，這是一種堿性牛奶蛋白酶，其具有切割β-酪蛋白的K28-K29和αs2-酪蛋白的K21-Q22的胰蛋白酶的特異性。這兩種肽通過(guò)內(nèi)肽酶和氨肽酶以及賴氨酰羧肽酶的作用進(jìn)一步水解。因此CPPs可以被認(rèn)為是干酪中暫時(shí)存在的中間成分。它們要么積聚，要么被干酪酶降解成更短的肽和游離氨基酸，包括磷酸化的絲氨酸，大多數(shù)CPPs來(lái)自β-酪蛋白的區(qū)域（14-28）。特定肽的積總是取決于生產(chǎn)和降解酶與母體底物可利用性之間的微妙平衡。在Ragusano干酪的中，鑒定的可溶性肽的數(shù)量在成熟4個(gè)月和7個(gè)月后分別從123顯著降低至47和25[31-32]。

據(jù)報(bào)道，CPPs在腸道釋放并在發(fā)生礦物質(zhì)吸收的小腸（回腸）的底部積聚。因此，一些研究旨在研究CPPs是否可以增加礦物質(zhì)吸收，尤其是Ca2+吸收。雖然這些研究為CPPs改善礦物質(zhì)吸收提供了可觀的證據(jù)，但結(jié)果仍存在爭(zhēng)議[33]。CPPs的作用影響也可能受到群體身體狀況、CPPs水平和鈣磷比值的影響。

表2 部分干酪中來(lái)自于αs1-，αss-和β-酪蛋白的磷酸肽

（續(xù)表2）

7 結(jié) 論

干酪在世界各地被廣泛的消費(fèi)，并且在對(duì)人類的健康中發(fā)揮重要作用，例如，降血壓和抗氧化等。干酪的組成證明了它是一個(gè)良好的生物活性物質(zhì)釋放基質(zhì)。雖然已有大量的研究證明干酪中的肽能給人類的健康帶來(lái)益處，但是仍有必要通過(guò)一定的技術(shù)手段進(jìn)一步鑒定分離生物活性肽，如代謝組學(xué)的應(yīng)用。此外，實(shí)施新鮮和成熟干酪中生物活性肽對(duì)健康影響的體內(nèi)和體外研究證明也是相當(dāng)必要的。