牦牛酥油功能性中鏈脂肪酸（MCFA）和支鏈脂肪酸(BCFA)純化工藝研究

袁錦瑩,孫萬(wàn)成,羅毅皓

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，食品加工與安全，西寧810016）

0 引 言

牦牛酥油是以傳統(tǒng)手工工藝從牦牛乳中提煉出的奶油，能為人體提供充足能量，并且具有保健功能[1-2]。研究表明，牦牛酥油中飽和脂肪酸的組成及含量與普通牛乳極為相似[3-4]。其飽和脂肪酸（SFA）與不飽和脂肪酸（UFA）含量均高于普通奶油[5]。喻峰等[6-7]報(bào)道了牦牛酥油中的UFA對(duì)人體健康具有意義，但對(duì)于酥油當(dāng)中的其他脂肪酸組分目前鮮有報(bào)道。

研究證實(shí)中鏈脂肪酸（MCFA）能夠降低體重、減少體脂及改善血脂代謝，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化及心腦血管疾病帶來(lái)有益的作[8-10]。而支鏈脂肪酸（BCFA）對(duì)人體具有獨(dú)特而重要的功能和作用,如防止壞死性小腸結(jié)腸炎[11-12]，同時(shí)有研究表明BCFA還具有抗癌作用[13-14]。

尿素絡(luò)合是脂肪酸分離純化的傳統(tǒng)方法，利用尿素分子將SFA及MUFA絡(luò)合，以達(dá)到分離純化目的[15-16]。結(jié)晶溫度越低，尿素用量越多，所得純度越高[17]?；诖?，本研究采用過(guò)氧乙酸氧化法除去不飽和組分原理，結(jié)合尿素絡(luò)合對(duì)牦牛酥油中的功能性脂肪酸進(jìn)行分離純化，為牦牛酥油開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

牦牛酥油，青海果洛；尿素，上海廣諾化學(xué)科技有限公司；氫氧化鉀，天津紅巖試劑廠；無(wú)水硫酸鈉，天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司；無(wú)水乙醇，天津富宇精細(xì)化工有限公司；正己烷，天津富宇精細(xì)化工有限公司；過(guò)氧乙酸，天津富宇精細(xì)化工有限公司；正丁醇，天津富宇精細(xì)化工有限公司；三氟化硼甲醇，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；定性濾紙撫順東陽(yáng)工貿(mào)有限公司；廣泛試紙，杭州試三科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（JM-B 3003），諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司；恒溫振蕩器（THZ-32），常州國(guó)華電器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-2000B），上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；旋渦混合器（MVS-1），北京東方開(kāi)物科學(xué)器材有限公司；醫(yī)用離心機(jī)（LC-04C），江蘇正基儀器有限公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（DSQⅡ），賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 游離脂肪酸的制備

采用皂化-酸化法制取游離脂肪酸。酥油中的脂肪與堿發(fā)生皂化，生成脂肪酸鹽。此外其中的游離脂肪酸也可與堿發(fā)生中和反應(yīng)，生成脂肪酸鹽。再經(jīng)酸化，被有機(jī)溶劑萃取便可制得混合的游離脂肪酸。吳明一[22]在用尿素絡(luò)合純化葵花籽油的不飽和脂肪酸的研究中，便是采用皂化-酸化法制備混合脂肪酸。Udaya N等[23]在用尿素絡(luò)合法純化海豹油的omega 3系列多不飽和脂肪酸也是用同等方法制取混合脂肪酸。

1.3.2 脂肪酸甲酯的制備

取適量（30 g）游離脂肪酸，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的硫酸-甲醇溶液100 mL，錫紙封口后60℃水浴30 min。待冷卻后加入50 mL的正己烷及50 mL飽和NaCl溶液，萃取取正己烷層。正己烷層水洗至呈中性后，再次萃取出正己烷層，用適量無(wú)水Na2SO4吸水干燥后過(guò)濾。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（40℃）旋蒸獲得游離脂肪酸甲酯，低溫（-20℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 脂肪酸甲酯的過(guò)氧化

脂肪酸甲酯的過(guò)氧化目的是使不飽和脂肪酸的雙鍵氧化生成飽和脂肪酸。加入過(guò)氧乙酸（過(guò)氧化氫與乙酸1:1配置），設(shè)定三個(gè)單因素脂肪酸與過(guò)氧乙酸比值為1:1、1:2、1:3反應(yīng)以判斷過(guò)氧化程度[24]。再加入正己烷進(jìn)行萃取，取正己烷層。將正己烷層水洗至呈中性后，再次萃取出正己烷層，用適量無(wú)水Na2SO4吸水干燥后過(guò)濾。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（40℃）旋蒸獲得過(guò)氧化后的游離脂肪酸甲酯，低溫（-20℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 過(guò)氧化去除不飽和脂肪酸及生成環(huán)氧脂肪酸

1.3.4 一次絡(luò)合

絡(luò)合結(jié)晶：取15 g上述過(guò)氧化后所得游離脂肪酸甲酯，加入脂肪酸與尿素比值1:2和甲醇（甲醇：尿素+脂肪酸甲酯，5:1）。封口后，60℃水浴并振蕩至澄清透明。放置冰箱4℃，8-10 h保存，絡(luò)合結(jié)晶。之后對(duì)所得液相和固相（結(jié)晶絡(luò)合物）進(jìn)行抽濾，并用少量甲醇沖洗瓶壁和濾渣，獲得固相（UCF）和液相（NUCF）。

NUCF處理：用鹽酸溶液酸化至pH 2-3后加入飽和食鹽水。隨后用正己烷萃取，取正己烷層。水洗至呈中性后，再次萃取出正己烷層，用適量無(wú)水Na2SO4吸水干燥后過(guò)濾。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（40℃）旋蒸獲得游離脂肪酸甲酯，低溫（-20℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

UCF處理：同NUCF。

1.3.5 二次絡(luò)合

取上述脂肪酸甲酯，加入適量KOH-甲醇溶液，封口后于恒溫振蕩器60℃1 h，并振蕩。用鹽酸溶液酸化至pH 2-3。隨后進(jìn)行破乳、萃取、水洗及干燥、蒸發(fā)等步驟，獲得游離脂肪酸。之后進(jìn)行丁酯化，用1%（W/W）的硫酸的正丁醇溶液酯化，得到丁脂，后續(xù)操作為破乳、萃取、水洗及干燥、蒸發(fā)得到脂肪酸丁酯。尿素絡(luò)合脂肪酸丁酯。（4℃，8-10 h保存后抽濾、酸化、破乳、萃取、水洗及干燥、蒸發(fā)），最終獲得脂肪酸丁酯。

1.3.6 GC-MS的前處理--甲酯化

甲酯化將脂肪酸中的高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的組分轉(zhuǎn)化成低沸點(diǎn)易揮發(fā)的脂肪酸甲酯，以進(jìn)行GC-MS分析。本研究以三氟化硼作為催化劑，對(duì)游離脂肪酸進(jìn)行甲酯化。

取100微升脂肪酸樣，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15的BF3甲醇4 mL，封住試管口后，90℃水浴30~60 min，冷卻后加入2 mL的正己烷，振搖，加入2 mL的飽和食鹽水，振搖。3 500 r/min離心5 min。取正己烷層于另一支干燥試管中，加入少量無(wú)水硫酸鈉除濕，振搖。輕輕吸取正己烷層于新的干燥試管，在氮?dú)庀麓蹈?，此時(shí)油脂析出附著在管壁，用0.5 mL正己烷再次潤(rùn)洗收集油脂得到甲酯化樣品以備GC-MS分析。

1.3.7 GC-MS分析

氣相色譜-質(zhì)譜分析：柱子型號(hào)DB-5MS 60m×0.25 mm×0.25μm廣州費(fèi)尼根儀器有限公司；色譜柱：柱子型號(hào)為ZB-5MS 60 m×0.25 mm×0.25μm。起始溫度60℃保持1 min，以10℃/min升至180℃，再以4℃/min升至280℃，保持20 min；再以20℃/min升至，保持2 min。進(jìn)樣孔溫度為280℃。載氣：高純He(99.999%)，流速為1 mL/min。連接桿溫度為285℃。離子源溫度為250℃。溶劑延遲時(shí)間7 min。質(zhì)量掃描范圍：40~550 u。

用化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)檢索譜圖庫(kù)，進(jìn)行譜圖解析，確認(rèn)各個(gè)脂肪酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。用峰面積歸一化法定量計(jì)算各脂肪酸的相對(duì)含量。

1.3.8 計(jì)算

1.3.9 統(tǒng)計(jì)方法

利用SPSS 16.0軟件分析統(tǒng)計(jì)組的差異性，采用最小顯著差數(shù)法，計(jì)量數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示脂肪酸差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 富集相的確定

表1 固相（UCF）和液相（NUCF）脂肪酸成分對(duì)比

從表1可看出，尿素絡(luò)合后液相（NUCF）中的MCFA、PUFA及BCFA含量分別為15.72%、5.94%和13.67%，而在固相（UCF）中分別為3.9%、0.91%和1.2%。因此可判斷，尿素絡(luò)合純化牦牛酥油的中鏈脂肪酸（MCFA）及支鏈脂肪酸（BCFA）的富集相是液相（NUCF）。

2.2 不同比例過(guò)氧乙酸對(duì)過(guò)氧化程度的影響

2.2.1 不同脂肪酸/過(guò)氧乙酸比值對(duì)兩次絡(luò)合終產(chǎn)物的影響

表2 不同脂肪酸/過(guò)氧乙酸比值對(duì)兩次絡(luò)合終產(chǎn)物的影響

從表2可看出，脂肪酸/過(guò)氧乙酸不同比值對(duì)兩次絡(luò)合后的產(chǎn)物有不同影響，原酥油中的中鏈脂肪酸（MCFA）相對(duì)含量為6.37%、支鏈脂肪酸（BCFA）相對(duì)含量為3.31%、多不飽和脂肪酸（PUFA）相對(duì)含量為1.74%。兩次絡(luò)合后，脂肪酸/過(guò)氧乙酸比值1:2時(shí)MCFA的純度最高，達(dá)到28.66%，脂肪酸/過(guò)氧乙酸比值1:3時(shí)BCFA的純度最高，達(dá)到15.91%。C16:0、C18:1n9、C18:0等在原料酥油中含量較多，但在試驗(yàn)處理后含量大幅度降低，主要的原因是尿素分子能夠較好絡(luò)合C16:0、C18:0，使其轉(zhuǎn)入到固相而去除；C18:1n9相對(duì)含量較大幅度降低的主要原因是其雙鍵被氧化形成環(huán)氧脂肪酸和飽和脂肪酸[21]。

2.2.2 脂肪酸/過(guò)氧乙酸比值1:3時(shí)各階段產(chǎn)物的脂肪酸成分變化

表3 脂肪酸/過(guò)氧乙酸比值1:3時(shí)各階段產(chǎn)物的脂肪酸成分比較

從表3可知，將脂肪酸甲酯過(guò)氧化后脂肪酸成分發(fā)生了顯著性差異（P<0.01），MCFA純度由最初的6.37%提高到67.7%，提高近10倍左右，可能原因是長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸被強(qiáng)烈的氧化，在雙鍵位置發(fā)生斷裂，生成了中鏈脂肪酸。PUFA在過(guò)氧化后有一定程度的降低，兩次絡(luò)合后BCFA相對(duì)含量升高近5倍。尿素絡(luò)合法能夠分離純化BCFA，是因?yàn)槟蛩啬軌蚪j(luò)合SFA及MUFA，與之形成較穩(wěn)定的絡(luò)合物[16，21]。

由圖2和圖3可知，過(guò)氧化酥油產(chǎn)物中產(chǎn)生大量C10:0和C12:0，可能致使C18:1n9被強(qiáng)烈氧化，發(fā)生雙鍵部位的斷裂二生成C10:0和C12:0；也可能是由于尿素分子不能絡(luò)合C10:0和C12:0脂肪酸，而使其富集液相（NUCF）部分。

圖2 原酥油GC/MS圖譜（C8:0,RT11.55,area0.05%;C10:0,RT14.62,area0.54%;C12:0,RT17.94,area3.03%）

圖3 過(guò)氧化酥油GC/MS圖譜（C8:0,RT11.52,area15.37%;C10:0,RT14.58,area24.5%;C12:0,RT17.84,area25.1%;）

此外，在進(jìn)行過(guò)氧化與兩次絡(luò)合后產(chǎn)生了新的中間產(chǎn)物—環(huán)氧脂肪酸甲酯，脂肪酸/過(guò)氧乙酸比值1:3時(shí)二次絡(luò)合后的相對(duì)含量為11.56%。環(huán)氧脂肪酸甲酯是類常用環(huán)保增塑劑，在塑料加工中添加增塑劑可使材料柔韌性增強(qiáng)。但普遍使用的增塑劑為人工合成的鄰苯二甲酸酯類化學(xué)物質(zhì)，會(huì)對(duì)人體的生殖、免疫、消化系統(tǒng)帶來(lái)危害。環(huán)氧脂肪酸甲酯作為一種新型的高分子材料助劑，對(duì)人體無(wú)毒無(wú)害，其極性部分（包括酯基和環(huán)氧基團(tuán)）可與聚氯乙烯（PVC）的極性部分相互作用，其非極性部分（直鏈烴基）介入PVC材料分子鏈間，削弱了分子鏈間的應(yīng)力，從而增加了分子鏈的移動(dòng)性、降低了分子鏈的結(jié)晶度，使PVC的塑性增加[22-23]。

3 結(jié) 論

經(jīng)過(guò)過(guò)氧化處理后中鏈脂肪酸（MCFA）的純度達(dá)到67.7%，提取率為850%。純度比原酥油提高10倍左右。過(guò)氧化的最佳比值為脂肪酸/過(guò)氧乙酸1:3，兩次絡(luò)合條件為脂肪酸與尿素比值為1:3，支鏈脂肪酸（BCFA）純度達(dá)到15.91%，比原酥油提高5倍左右，得率為21.57%。此外還獲得純度較高的環(huán)氧脂肪酸甲酯，相對(duì)含量達(dá)到11.59%。根據(jù)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)過(guò)氧化處理可有效提高酥油中的MCFA純度，并獲得新的中間產(chǎn)物環(huán)氧脂肪酸甲酯，具有一定研究意義，結(jié)合尿素絡(luò)合工藝也可有效提高BCFA純度，為牦牛乳制品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供新的理論依據(jù)。