層粘連蛋白對奶牛乳腺上皮細胞乳蛋白表達的調控

王春梅，門晶晶，李璐，張娜，王保勝，趙鋒

（東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

0 引 言

泌乳期奶牛的產(chǎn)奶量是由泌乳乳腺上皮細胞的數(shù)目和分泌能力決定的，而特定環(huán)境下細胞內外的信息交流是決定單個乳腺上皮細胞合成和分泌乳成分的直接因素。在正常生理狀態(tài)下，乳腺上皮細胞借助于細胞表面的黏附分子錨定在細胞外基質（extracelular matrix，ECM）上，通過細胞-ECM相互作用實現(xiàn)信號轉導，共同調控乳腺發(fā)育與泌乳。

基膜屬于一種特化的ECM，在體內位于乳腺上皮細胞基底側，是細胞黏附錨定的平臺。近些年，一些涉及到乳腺上皮細胞體外模型建立的研究發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)在重組的基膜凝膠上時，乳腺上皮細胞表現(xiàn)出呈圓形，聚集成簇，具有細胞連接和頂-基底極性的特點。這種三維“mammospheres”與體內泌乳期腺泡十分類似，具備合成分泌乳蛋白的能力。因此，乳腺上皮細胞和周圍基膜的相互作用是乳腺發(fā)育過程中表型變化的關鍵調控因素[1]。

基膜誘導的乳腺上皮細胞泌乳功能分化事件往往早于全面的腺泡形態(tài)發(fā)生[2]。例如，含基膜蛋白成分的培養(yǎng)液誘發(fā)尚不具備泌乳功能的乳腺上皮細胞融合單層中的細胞形態(tài)收攏呈圓形，并且部分細胞發(fā)生分化[3]，同時誘發(fā)乳鐵蛋白基因表達[4]。在體內，乳鐵蛋白是妊娠早期最先表達的乳蛋白。而一旦當這些“圓”細胞形成，第二種乳蛋白β-酪蛋白的基因被迅速的誘導表達[5]。在體內，β-酪蛋白是妊娠中期最先表達的乳蛋白。顯然，細胞形態(tài)的改變使得它們能夠快速應答基膜激活的泌乳分化信號，為其他乳蛋白合成信號轉導途徑做準備[6]。

在小鼠中的實驗結果顯示，乳腺上皮細胞實現(xiàn)泌乳功能分化至少需要兩種類型信號，促（催）乳激素（如催乳素、胰島素和氫化可的松）和基膜[7]，進一步研究表明，基膜的主要成分——層粘連蛋白（laminin，LN）與催乳素的聯(lián)合效應是細胞實現(xiàn)泌乳分化的必要條件。例如，富含LN的細胞外基質作為培養(yǎng)底物時，用催乳素（22 ku肽激素）刺激，信號分子PI3K被限定在基底側[8]，有利于JAK2-STAT5途徑的正確激活[9-10]，而在缺少LN的對照基質條件下，JAK2-STAT 5途徑只能短暫激活，不能啟動乳蛋白基因表達[9]。在體內和原代組織培養(yǎng)模型敲除β1整聯(lián)蛋白基因，動物個體表現(xiàn)為腺泡形態(tài)缺陷，STAT5不能轉位入核，抑制催乳素激活的JAK2-STAT5途徑[11-12]。因此，β1整聯(lián)蛋白和LN的相互作用也是維持STAT 5活性的必要條件，也就是說β1整聯(lián)蛋白介導了LN與催乳素的聯(lián)合效應[9]。

整聯(lián)蛋白亞基α6、β1和β4能形成兩種整聯(lián)蛋白異二聚體α6β1、α6β4，它們都是LN的細胞表面受體。而實際上，在包括牛在內的大多數(shù)動物乳腺組織也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種整聯(lián)蛋白亞基（包括α6、β1和β4）表達于乳腺上皮細胞。另外，Murney R等在分析不同擠奶頻率的奶牛乳區(qū)的泌乳能力差異時，發(fā)現(xiàn)β1整聯(lián)蛋白豐度變化可能是先影響了BMECs的PRL應答能力，進而實現(xiàn)調控BMECs分泌活性的[13]。

在BMECs體外培養(yǎng)時，β1整聯(lián)蛋白表達對其乳成分合成究竟有何影響，LN和PRL信號是否需要β1整聯(lián)蛋白介導，尚需進一步闡明。因此，本實驗以健康泌乳期奶牛的乳腺上皮細胞為實驗對象，以LN為底物，使用含有催乳素的分化培養(yǎng)液誘導細胞的乳蛋白合成。通過檢測BMECs中β1整聯(lián)蛋白的表達，分析其表達與β-酪蛋白合成的關系，對闡明上述問題進行了初步探索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

VE-108B垂直電泳槽（Tanon），VE-186濕轉電泳槽（Tanon），PrimeScript TMRT Reagent Ki（t TaKa-Ra），SYBR Premix Ex TagTM試劑盒（TaKaRa），紫外分光光度計（Thermo），冰凍切片機（Leica），激光共聚焦掃描顯微鏡（Leica TCS SP2），流式細胞儀（BD，F(xiàn)ACSAriaTMIIu），熒光定量PCR儀（Roche，LightCycle480）。

1.2 試驗動物與取材

樣本組織取自屠宰點奶牛泌乳乳腺，一部分切割成小塊，-80℃凍存?zhèn)溆?，其余組織采用酶消化法，獲取原代奶牛乳腺上皮細胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs）進行純化培養(yǎng)。

1.3 細胞培養(yǎng)與分組

純化后的細胞制成細胞爬片，對上皮細胞分子標志角蛋白18（Cytokeratin，CK18）、角蛋白5（Cytoketin 5，CK5）、MYH 11和培養(yǎng)底物包被的Transwell小室中細胞生長曲線進行檢測。

經(jīng)生物學特性鑒定符合泌乳調控條件的細胞繼續(xù)培養(yǎng)擴群，取4-8代細胞轉移至Transwell培養(yǎng)體系進行泌乳功能調控。具體流程如下：將上室加入1 mL PBS（LN終濃度30μg/mL），置超凈臺上過夜風干，制成LN包被板待用，同等濃度BSA包被板作為陰性對照組。將在培養(yǎng)瓶（T 25）中處于對數(shù)生長期的奶牛乳腺上皮細胞按105個/孔左右接種至上室中，37℃，5%CO2培養(yǎng)，每組設3個復孔，使用含雙抗和5%胎牛血清的DMEM-F12接種培養(yǎng)液至細胞50%融合，再次下調胎牛血清濃度為2%培養(yǎng)至細胞85%左右融合，更換為無血清分化培養(yǎng)基（含催乳素1μg/mL，胰島素5μg/mL，氫化可的松5μg/mL的DMEM-F12培養(yǎng)液）。分化培養(yǎng)24 h后，提取細胞總RNA和總蛋白用于后續(xù)qRT-PCR和WB檢測。

1.4 流式細胞檢測

純化后的BMECs接種到6孔板培養(yǎng)至90%左右融合，至少收集106個細胞，PBS洗滌1次，1 mL固定透膜劑（BD）4℃放置20 min，PBS洗滌2次。AF488-CK18（Bioss）一抗（含3%BSA的PBS稀釋）5μg/106個細胞，4℃避光放置40 min，每隔一段時間輕輕搖勻細胞。對照組不加一抗。PBS洗滌2次，用500μL PBS重懸細胞，上機。

1.5 組織與細胞免疫熒光

凍存乳腺組織制成8μm冰凍切片，乳腺上皮細胞制成細胞爬片。4%多聚甲醛4℃固定10 min，PBS/T漂洗2×5 min。5%BSA 37℃封閉1 h；CK18、CK5一抗均采用AF488直標抗體（Bioss）、MYH11一抗采用FITC直標抗體，均按1∶200稀釋，整聯(lián)蛋白β1一抗采用大鼠單克隆抗體（DSHB），按1∶20稀釋，4℃孵育過夜，隔天PBS/T漂洗3×5 min；整聯(lián)蛋白β1二抗（1∶400）采用AF488-山羊抗大鼠IgG（Bioss）37℃孵育1 h，PBS/T漂洗3×5 min。0.02 mg/mL DAPI37℃染核10 min，PBS/T漂洗3×5 min，抗熒光猝滅劑封片。

1.6 RNA提取與實時熒光定量PCR

使用組織細胞RNA微量提取試劑盒（Magen），從乳腺組織中提取總RNA，NanoDrop 2000檢測RNA濃度，OD260nm/OD280nm確定RNA純度。按照逆轉錄試劑盒說明，將總RNA反轉錄成cDNA。qRT-PCR上機采用20 uL體系，反應程序：95℃，30 s預變性。95℃，5 s；60℃，30 s；進行40個的循環(huán)。cDNA模板按5-100倍稀釋（<100 ng），上下游引物均按0.4μmol/L添加，如表1。

表1 引物序列

1.7 蛋白提取與蛋白印跡

MinuteTM總蛋白提取試劑盒（Invent）提取細胞總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天）測定蛋白濃度，按每孔20 ug總蛋白上樣，8%SDS-PAGE（凝膠快速配制試劑盒，碧云天）電泳，濕轉至NC膜。內參β-actin一抗為小鼠單克隆抗體（Bioss），二抗HRP-山羊抗小鼠IgG（中杉金橋）。β-酪蛋白、整聯(lián)蛋白β1一抗均為兔單克隆抗體（Bioss）、二抗HRP-山羊抗兔IgG（中杉金橋）。使用Sag Capture（天能，Tanon 5200）對蛋白條帶進行掃描，使用Imagine Pro-plus6.0軟件讀取蛋白灰度值。

1.8 統(tǒng)計分析

采用SPSS21.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。所有分析數(shù)據(jù)至少來自3次獨立實驗，每次實驗至少3個平行，用獨立樣本t檢驗檢驗差異顯著性，數(shù)據(jù)結果用平均值（x）±標準差（SD）表示。

2 結果與討論

2.1 奶牛乳腺上皮細胞的生物學特性

對酶消化法純化后的乳腺上皮細胞進行免疫熒光鑒定，如圖1a在激光共聚焦顯微鏡下可以觀察到位于拉絲狀細胞骨架的CK18信號（綠色），DAPI染核可觀察到卵圓形的細胞核（藍色），同時流式細胞儀技術檢測結果如圖1b顯示CK18陽性率達到98.9%。如圖1c所示我們對肌上皮細胞的分子標志MYH 11以及體內基底側乳腺上皮細胞的分子標志CK5也進行了檢測，并沒有檢測到陽性信號的存在。Malven等證實牛乳腺組織產(chǎn)生催乳素，近年來對嚙齒類動物的研究表明自分泌催乳素對于泌乳分化有著至關重要的作用[14-15]，因此它在牛乳腺中也可能具有自分泌作用。qRT-PCR結果如圖2所示，顯示BMECs自分泌的PRL mRNA表達水平極低或未檢出，添加LN對自分泌PRL基因表達未產(chǎn)生顯著影響。BMECs在兩種培養(yǎng)底物包被的Transwell小室中的生長速度基本一致，根據(jù)細胞生長曲線如圖3所示，我們選擇在細胞接近80%融合時（3 d）更換分化培養(yǎng)基處理24 h?？傊?，對純化后細胞幾項生物學特性的檢測表明，我們獲得了較為均一的奶牛乳腺上皮細胞，未混雜肌上皮細胞和基底側未分化細胞[16-17]，也可以排除或忽略實驗體系中微量內源性PRL的干擾[15]。

圖1 純化后BMECs中的細胞分子標志

圖2 自分泌催乳素qRT-PCR擴增曲線

圖3 不同培養(yǎng)底物包被Transwell小室中的細胞生長曲線

2.2 整聯(lián)蛋白β1和α6亞基的表達定位

實驗獲取3頭泌乳奶牛乳腺組織，每頭奶牛至少取用3塊樣本，每塊樣本至少制取檢測3張6~8μm的冰凍切片，泌乳奶牛乳腺的組織結構如圖4a和4b所示，乳腺小葉由結締組織分割而成，每個腺泡是單層腺上皮細胞圍繞而成的空泡樣結構，每個小葉由幾十個至上百個形態(tài)和大小不同的腺泡組成，而這種差異是由于腺泡分泌活動不一致決定的。

圖4 泌乳奶牛乳腺組織結構示意圖

整聯(lián)蛋白表達熒光定位結果如圖5a所示，整聯(lián)蛋白β1主要定位于泌乳腺泡細胞的基底側細胞，借助藍色細胞核輔助定位，可以判斷出部分位于基底側細胞信號分布在基底側細胞膜一側。相鄰腺泡細胞間側信號較弱，朝向腺泡腔的細胞頂膜信號微弱或無信號。細胞間質區(qū)域的梭形成纖維細胞以及其他間質細胞也檢測到整聯(lián)蛋白β1信號，但是不同于基底側腺泡細胞的極性分布，這些信號環(huán)繞整個細胞膜。

圖5 整聯(lián)蛋白β1的表達定位

同時，我們對分離自不同批次的奶牛乳腺的BMECs進行體外培養(yǎng)，每個處理組的BMECs至少制作3張細胞爬片，來觀察β1整聯(lián)蛋白亞基在體外培養(yǎng)的BMECs中的表達定位，代表性結果如圖5b所示，無論是否添加外源LN作為培養(yǎng)底物，β1整聯(lián)蛋白亞基均有表達，從細胞頂部至基底部沿Z軸進行掃描，同時借助細胞核輔助定位，在接近細胞基底部檢測到較強的熒光信號，這與在組織切片觀察到的極性分布模式一致。在基底側表達的定位特點決定了整聯(lián)蛋白β1能夠通過簇集與LN充分結合形成活性構型，并且也是其與其他激素和生長因子受體形成蛋白復合物的前提條件[18-19]。

2.3 LN對BMECs中整聯(lián)蛋白β1亞基表達的影響

為了證實基膜主要成分LN對于BMECs中整聯(lián)蛋白β1亞基mRNA和蛋白水平表達豐度的影響，實驗中在Transwell上室底部膜上包被LN，人為模擬細胞生長的極性環(huán)境，另外在下室添加含HIP催乳復合物的DMEMF12培養(yǎng)液，從基底側定向刺激細胞對泌乳分化作出應答。培養(yǎng)24 h后，收集細胞，分別提取總RNA和總蛋白，進行qRT-PCR和WB的檢測，結果如圖6，圖7所示：包被LN組與BSA組相比，ITGB1的表達水平無顯著差異（P>0.05），整聯(lián)蛋白β1亞基蛋白水平差異顯著（P<0.01）。

圖6 LN對BMECS中整聯(lián)蛋白β1mRNA水平表達的影響

圖7 LN對BMECS中整聯(lián)蛋白β1蛋白水平表達的影響

整聯(lián)蛋白作為一種膜蛋白能夠參與細胞的內吞外排，它的蛋白表達水平由mRNA豐度、蛋白循環(huán)速率和降解速率幾方面共同決定，我們的實驗結果表明添加LN底物未能改變整聯(lián)蛋白β1的mRNA表達，但可能通過增加整聯(lián)蛋白循環(huán)速率或是抑制其降解實現(xiàn)的[18-19]。

2.4 LN對BMECs中乳蛋白表達的影響

圖8 LN對BMECS中乳蛋白mRNA水平表達的影響

圖9 LN對BMECS中β-酪蛋白蛋白水平表達的影響

為了驗證LN對于乳蛋白表達的影響，實驗中添加催乳復合物對BMECs進行24 h的泌乳分化刺激，允許BMECs有足夠的時間在乳蛋白mRNA和蛋白水平上都發(fā)生變化。結果如圖8、圖9所示：包被LN組與BSA組相比，乳鐵蛋白mRNA表達水平差異極顯著（P<0.01）。包被LN組與BSA組相比，β-酪蛋白在mRNA和蛋白表達水平均差異顯著（P<0.01）。包被LN組與BSA組相比，CSN 2的蛋白表達水平差異顯著（P<0.01）

LN的存在，顯然有利于乳鐵蛋白和β-酪蛋白的表達，促進了BMECs的泌乳分化。有許多研究已經(jīng)證實催乳復合物中的催乳素能夠通過結合受體激活下游信號分子Stat5，作為一種轉錄調節(jié)因子，Stat5與β酪蛋白mRNA豐度和蛋白水平密切相關，結合本實驗中LN引起的β-酪蛋白上調伴隨著β1亞基蛋白的同步上調，以及前言中提到的研究報道β1亞基豐度增強BMECs對催乳素的應答能力[13，20-21]，我們推斷LN可以通過上調β1亞基豐度來協(xié)助催乳素實現(xiàn)促進β-酪蛋白表達的作用。此外，乳鐵蛋白是妊娠早期最先表達的乳蛋白，是BMECs處于生乳第一階段的特征，而在奶牛血液中催乳素的濃度直到生乳第二階段（妊娠中后期）才逐漸升高，臨近分娩時達到高峰，這期間伴隨著β-酪蛋白合成與分泌的啟動，顯然催乳素與奶牛早期泌乳分化關聯(lián)不大[22]，在體外也并沒有研究提供直接證據(jù)支持催乳素及其受體信號能夠增強乳鐵蛋白的表達，所以LN可能以一種不依賴于催乳素作用的方式來影響包括乳鐵蛋白在內的其他乳蛋白表達[23-25]。

3 結 論

作為一種細胞外基質，LN能影響其細胞表面受體整聯(lián)蛋白β1亞基的表達水平，進而通過其潛在的信號樞紐作用來增強BMECs對催乳素信號的應答水平，上調相關乳蛋白β-酪蛋白的蛋白合成。LN也具有非催乳素依賴性促泌乳分化作用，誘導或增強包括乳鐵蛋白在內的其他不受催乳素信號調控的乳蛋白表達。