西藏牧區(qū)自然發(fā)酵牦牛酸奶的乳酸菌菌種篩選及工藝優(yōu)化

廖鈺婷，吳 均，龍 謀，杜木英,2,3,*，闞建全,2,3

西藏牧區(qū)自然發(fā)酵牦牛酸奶的乳酸菌菌種篩選及工藝優(yōu)化

廖鈺婷1，吳 均1，龍 謀1，杜木英1,2,3,*，闞建全1,2,3

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715；3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室（重慶），重慶 400715）

采用從西藏、川西青藏高原牧區(qū)自然發(fā)酵牦牛酸奶中篩選出的發(fā)酵性能優(yōu)良的4株乳酸菌（LP1、LP2、LP3、LP4）進行組合發(fā)酵試驗，經(jīng)過紙片法篩選出優(yōu)勢發(fā)酵組合，以及其發(fā)酵牦牛酸奶的凝乳時間、滴定酸度、感官評價可以得出（LP1和LP2）組合為本試驗的最佳發(fā)酵菌種組合。因此選用此菌種組合發(fā)酵牦牛酸奶，經(jīng)過L16（44）正交試驗得出牦牛酸奶發(fā)酵的最佳工藝條件為：發(fā)酵溫度42℃、接種量6%、加糖量4 g/100 mL、菌種LP1與LP2濃度比為2∶1，此條件下發(fā)酵的牦牛酸奶凝固均勻，組織結(jié)構(gòu)光滑細膩，無乳清析出，具有濃郁的酸奶風味。

牦牛酸奶；乳酸菌；組合發(fā)酵；工藝優(yōu)化

我國青藏高原地區(qū)具有大量優(yōu)質(zhì)的牦牛乳，但除了少量鮮乳被直接飲用外，其余大部分用于制作成日常食用的奶茶、酥油茶、奶油、奶餅、傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶和一些地區(qū)獨特的食物等[1-2]，特別是發(fā)酵乳制品，牧民們在制作方面有著較為豐富的經(jīng)驗和知識，形成了獨具地域特色的傳統(tǒng)工藝，其制作和食用已有幾千年的歷史[3]。牦牛奶中含有人體所需的8種必需氨基酸及豐富的維生素[4-5]、微量元素[6]、乳鐵蛋白、溶菌酶及過氧化物酶[7]等，而且牦牛乳汁中神奇活性因子——共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）含量也較普通牛奶高[3]，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵成牦牛酸乳，相比普通酸牛乳，牦牛酸乳含有更高的功能性脂肪酸和蛋白質(zhì)[8]。傳統(tǒng)工藝制作的乳制品不僅含有豐富的乳酸菌，且很好地保存了其生物學多樣性，制成的發(fā)酵乳制品組織細膩、風味獨特、口感純正，富含乳酸、乙酸、不飽和脂肪酸、低分子脂肪酸、VC和B族維生素、氨基酸、共軛亞油酸[9]等物質(zhì)，具有良好的醫(yī)療保健功能、美容功效和濃郁的地域特色和風味，說明該地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)牦牛酸乳中具有傳代性好、活力高、后酸化能力好、產(chǎn)黏性強、抗逆性強、凝乳狀態(tài)好、風味獨特的優(yōu)良乳酸菌菌群[10-13]。隨著地區(qū)交流日益頻繁，牦牛乳走出牧區(qū)，逐漸被牧區(qū)以外的人們所喜愛，但由于資源和地域優(yōu)勢，國內(nèi)主要生產(chǎn)和加工牦牛乳的企業(yè)都分布在我國牦牛資源最多的幾大省區(qū)，如西藏、青海、甘肅、四川、云南[14]，并且目前牦牛乳資源未得到合理的開發(fā)利用[15]，而牦牛酸奶的工業(yè)化生產(chǎn)也比較薄弱，尚未有一個明確的菌種組合發(fā)酵工藝，為了滿足廣大消費者的需求以及生產(chǎn)加工出品質(zhì)更高的牦牛酸奶[16]，需要對傳統(tǒng)的牦牛酸奶發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。

本實驗選用從西藏、川西青藏高原牧區(qū)自然發(fā)酵牦牛酸乳中篩選出的發(fā)酵性能優(yōu)良的4株乳酸菌（LP1、LP2、LP3、LP4）為實驗菌株，進行組合篩選試驗和牦牛酸奶發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗，以期提高牦牛酸奶的品質(zhì)并且為其工業(yè)化提供最佳的發(fā)酵工藝。

1 材料與方法

1.1菌種與試劑

菌種：LP1、LP2、LP3、LP4，從青藏高原牧區(qū)自然發(fā)酵牦牛酸乳中分離得到。

牦牛奶粉西藏高原之寶牦牛乳業(yè)股份有限公司；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、瓊脂（生化試劑）北京奧博星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、MnSO4、檸檬酸二銨、無水乙酸鈉、酚酞、氫氧化鈉、乙醇（分析純）成都科龍化工試劑廠；鹽酸（分析純）重慶科試化學有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

DL-1型可控溫電爐北京中興偉業(yè)儀器有限公司；HPX-9052MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱、YXQ-SG46-280S壓力蒸汽滅菌鍋上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1FD型潔凈工作臺中日合資蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；GL-88B渦旋混合器海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HB031金屬恒溫加熱器上海博彩生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1指標測定

1.3.1.1凝乳時間[17]

將活化好的菌株按一定的比例接種到牦牛乳中，在適當?shù)臏囟认掳l(fā)酵至凝乳，記錄凝乳時間。

1.3.1.2滴定酸度

根據(jù)GB/T 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測定》方法進行測定。

1.3.1.3感官評定方法[18-20]

將凝固后的發(fā)酵乳置于4℃冷藏24 h后，從經(jīng)過嚴格感官評定培訓的師生中挑選出10名對牦牛酸奶的色澤、氣味和滋味、組織狀態(tài)進行感官評價，評定標準如表1所示。

表1 發(fā)酵乳感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented milk

1.3.2組合發(fā)酵實驗[21-22]

生產(chǎn)酸奶所使用的發(fā)酵菌株大多數(shù)為混合菌株，混合菌株混合發(fā)酵酸奶時具有的協(xié)同效應。選取具有優(yōu)良發(fā)酵性能的4株乳酸菌進行組合菌種篩選，挑選出具有協(xié)同作用的最佳組合。

1.3.2.1菌株間的拮抗實驗

采用紙片法，將活化好的待測乳酸菌制成菌懸液，把滅菌紙片（d=8 mm）浸于備用乳酸菌上清液中10 min。往直徑為90 mm滅菌平皿中注入20 mL MRS固體瓊脂培養(yǎng)基，平鋪均勻，待冷卻凝固后取200μL待測乳酸菌菌懸液涂布于培養(yǎng)基表面，用無菌鑷子等距離貼放4張滅菌紙片。37℃培養(yǎng)24 h，若在紙片周圍出現(xiàn)明顯的抑菌圈，則表明有抑菌活性，即兩株乳酸菌之間具有拮抗作用，反之則無，挑選出無拮抗作用的乳酸菌菌株。

1.3.2.2菌株優(yōu)勢組合發(fā)酵篩選實驗

選擇無拮抗作用的乳酸菌菌株，按菌種濃度1∶1的比例，5%的接種量接種到滅菌牦牛乳中，40 ℃發(fā)酵至凝乳后放入冰箱4℃冷藏24 h后進行感官評價，選出評分最高的組合。

1.3.3牦牛酸奶發(fā)酵工藝條件優(yōu)化[17,23-24]

1.3.3.1牦牛酸奶生產(chǎn)工藝流程[25]

牦牛奶粉→過濾及均質(zhì)→殺菌→冷卻→接種→適溫發(fā)酵→冷卻→后熟（4℃）→冷藏

1.3.3.2牦牛酸奶發(fā)酵溫度的單因素試驗

按1.3.3.1節(jié)的發(fā)酵工藝，添加4 g/100 mL的白砂糖，用篩選出的組合菌株，以5%的接種量接種發(fā)酵，分別在36、38、40、42、44、46℃的溫度條件下發(fā)酵至凝固，記錄時間，冷藏后熟后取樣測定滴定酸度，感官評價其風味效果，選擇適宜的發(fā)酵溫度水平。

1.3.3.3牦牛酸奶發(fā)酵接種量的單因素試驗

按1.3.3.1節(jié)的發(fā)酵工藝，添加4 g/100 mL的白砂糖，用篩選出的組合菌株，分別以2%、3%、4%、5%、6%、7%的菌種量接種，40℃發(fā)酵至凝固，記錄時間，冷藏后熟后取樣測定滴定酸度，感官評價其風味效果，選擇適宜的接種量水平。

1.3.3.4牦牛酸奶發(fā)酵加糖量的單因素試驗

按1.3.3.1節(jié)的發(fā)酵工藝，分別添加2、3、4、5、6、7 g/100 mL的白砂糖，用篩選出的組合菌株，以5%的接種量接種，40℃發(fā)酵至凝固，記錄時間，在冷藏后熟后取樣測定滴定酸度，感官評價其風味效果，選擇適宜的加糖量水平。

1.3.3.5牦牛酸奶發(fā)酵菌種配比的單因素試驗

按1.3.2.1節(jié)的發(fā)酵工藝，添加4 g/100 mL的白砂糖，將菌種分別以1∶1、1∶2、3∶2、2∶3、2∶1、3∶1的配比，以5%的接種量接種發(fā)酵，40℃發(fā)酵至凝固，記錄時間，在冷藏后熟后取樣測定滴定酸度，感官評價其風味效果，選擇適宜的菌種配比水平。

1.3.3.6牦牛酸奶發(fā)酵條件的正交試驗

為了優(yōu)化牦牛酸奶的發(fā)酵工藝，根據(jù)加糖量、接種量、發(fā)酵溫度、菌種濃度比單因素試驗確定的最佳水平，選取四因素四水平的正交試驗，通過感官評分分析，確定最佳工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1組合發(fā)酵實驗結(jié)果

2.1.1菌株間的拮抗實驗結(jié)果

表2 乳酸菌之間的拮抗實驗結(jié)果Table 2 Antagonistic interactions among four Lactobacillus isolates

利用紙片法對4株乳酸菌之間協(xié)同的關(guān)系進行研究，實驗出現(xiàn)了3種結(jié)果：無抑制、微弱抑制、抑制[24]，結(jié)果見表2。菌株LP1與LP2和LP3間均無抑制效果，與LP4有抑制效果；菌株LP2與LP4無抑制效果但與LP3有微弱抑制作用；菌株LP3與LP4有微弱抑制作用。由此可以得出在6對組合中，僅有3對菌株間存在共生作用，因此，在最終確定優(yōu)勢組合發(fā)酵篩選時，只需研究3種組合，分別為：Ⅰ（LP1和LP2）、Ⅱ（LP1和LP3）、Ⅲ（LP2和LP4）。

2.1.2菌株優(yōu)勢組合發(fā)酵篩選結(jié)果

將以上3種組合進行發(fā)酵并在同等條件下與單菌株發(fā)酵進行比較，并進行感官評價，選擇組合發(fā)酵性能的最優(yōu)組合，結(jié)果見表3。

表3 菌種組合發(fā)酵實驗結(jié)果Table 3 Fermentation performance of mixed LAB strains for yogurt production

由表3可知，組合發(fā)酵凝乳時間縮短；組合發(fā)酵的酸度比單一菌株發(fā)酵的酸度有所增加；感官評分上，酸乳的風味、滋味和氣味以及組織狀態(tài)等均非常好。因此，綜合以上指標及分析，可以得出Ⅰ組為本實驗的最佳發(fā)酵菌種組合，主要表現(xiàn)在凝乳時間較短，后熟后的酸度高，滿足優(yōu)良酸乳制品的條件，且貯存過程中酸度變化小，增強了酸乳品質(zhì)的穩(wěn)定性。

2.2牦牛酸奶發(fā)酵工藝條件的單因素試驗

2.2.1發(fā)酵溫度的影響

接種5%的組合Ⅰ（LP1與LP2濃度比1∶1）于添加了4 g/100 mL白砂糖的牦牛乳中，分別在36、38、40、42、44、46℃的溫度條件下發(fā)酵，冷藏后熟后取樣測定滴定酸度，進行感官評價，結(jié)果見表4。

表4 不同發(fā)酵溫度對牦牛酸奶的影響Table 4 Effects of different fermentation temperatures on yak yogurt

由表4可知，不同溫度條件下發(fā)酵的牦牛酸奶的凝乳時間、滴定酸度及其感官評分有一定差異，隨著溫度的上升，凝乳時間先縮短后增長，酸度逐漸增大，感官評分先增大后減小。當發(fā)酵溫度為36℃時，牦牛酸奶的凝乳時間最長，乳清析出較多，感官評分較低；當發(fā)酵溫度為46℃時，牦牛酸奶的凝乳時間最長，酸度最大，乳清析出多，感官評分較低；當發(fā)酵溫度為42℃時牦牛酸奶的感官評分最高，凝乳時間最短，口感滋味組織狀態(tài)最佳，發(fā)酵溫度為38、40、42、44℃時，牦牛酸奶外觀光滑，口感較好，酸乳氣味濃郁，因此選取38、40、42、44℃進行正交試驗。

2.2.2接種量的影響

分別接種2%、3%、4%、5%、6%、7%的組合Ⅰ（LP1與LP2濃度比1∶1）于添加了4 g/100 mL白砂糖的牦牛乳中，在40℃條件下發(fā)酵，冷藏后熟后取樣測定滴定酸度，進行感官評價，結(jié)果見表5。

表5 不同發(fā)酵接種量對牦牛酸奶的影響Table 5 Effects of different inoculum amounts on yak yogurt

由表5可知，不同接種量發(fā)酵的牦牛酸奶的凝乳時間、酸度及其感官評分有一定差異，隨著接種量的增加，凝乳時間逐漸縮短，酸度逐漸增大，感官評分先增大后減小。當接種量為2%時，牦牛酸奶的凝乳時間最長，酸度最低，感官評分最低；當接種量為7%時，牦牛酸奶的滋味氣味不好，乳清析出較多，感官評分較低；當接種量為5%時，牦牛酸奶的感官評分最高，凝乳時間最短，口感滋味組織狀態(tài)最佳，接種量為3%、4%、5%、6%時，牦牛酸奶外觀光滑，口感較好，酸乳氣味濃郁，因此選取3%、4%、5%、6%的接種量進行正交試驗。

2.2.3加糖量的影響

接種5%的組合Ⅰ（LP1與LP2濃度比1∶1）于分別添加了2、3、4、5、6、7 g/100 mL的白砂糖的牦牛乳中，在40℃條件下發(fā)酵，冷藏后熟后取樣測定滴定酸度，進行感官評價，結(jié)果見表6。

表6 不同加糖量對牦牛酸奶的影響Table 6 Effects of different sucrose concentrations on yak yogurt

由表6可知，不同加糖量發(fā)酵的牦牛酸奶的凝乳時間、酸度及其感官評分有一定差異，隨著加糖量的增加，凝乳時間逐漸增大，酸度逐漸減小，感官評分先增大后減小。當加糖量為2 g/100 mL時，牦牛酸奶的酸度較高，感官評分較差；當加糖量為7 g/100 mL時，牦牛酸奶的凝乳時間最長，酸度最低，感官評分較差；當加糖量為4 g/100 mL時，牦牛酸奶的感官評分最高，凝乳時間最短，口感滋味組織狀態(tài)最佳，加糖量為3、4、5、6 g/100 mL時，牦牛酸奶的外觀光滑，口感較好，酸乳氣味濃郁，因此選取3、4、5、6 g/100 mL的加糖量進行正交試驗。

2.2.4菌種濃度比的影響

組合Ⅰ（LP1和LP2）按1∶1、1∶2、3∶2、2∶3、2∶1、3∶1的比例接種5%于添加了4 g/100 mL白砂糖的牦牛乳中，在40℃條件下發(fā)酵至凝固，記錄時間，冷藏后熟后取樣測定滴定酸度，進行感官評價，結(jié)果見表7。

表7 不同菌種濃度比對牦牛酸奶的影響Table 7 Effects of different LP1 to LP2 ratios on yak yogurt

由表7可知，不同菌種比發(fā)酵的牦牛酸奶的凝乳時間、酸度及其感官評分有一定差異。當菌種濃度比為1∶2和2∶3時牦牛酸奶的凝乳時間較長，酸度較低，感官評分較低；當菌種濃度比為3∶1時，牦牛酸奶的感官評分最高，凝乳時間最短，口感滋味組織狀態(tài)最佳，菌種濃度比為1∶1、3∶1、2∶1、3∶2時，牦牛酸奶外觀光滑，口感較好，酸乳氣味濃郁，因此選取1∶1、3∶1、2∶1、3∶2的菌種比進行正交試驗。

2.2.5牦牛酸奶發(fā)酵條件的正交試驗

表8 牦牛酸奶發(fā)酵工藝的L1166（444）正交試驗Table 8 Orthogonal array design L1166 ((444)with experimental values off titritable acidity and sensory score

表9 牦牛酸奶發(fā)酵工藝正交試驗方差分析Table 9 Analysis of variance of titritable acidity and sensory score

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取加糖量、接種量、發(fā)酵溫度、菌種濃度比4個因素，每個變量設(shè)定4個水平，進行四因素四水平的正交試驗，以產(chǎn)品的滴定酸度和感官評分為評價指標，確定最佳工藝參數(shù)。正交試驗結(jié)果及分析分別見表8、9。由表9可知，影響產(chǎn)品滴定酸度和感官評分的主要因素影響次序均為：D（菌種濃度比）＞B（接種量）＞A（發(fā)酵溫度）＞C（加糖量），通過分析可知最優(yōu)組合為A3B4C2D2，即選擇發(fā)酵溫度為42℃、接種量為6%、加糖量為4 g/100 mL、菌種濃度比為2∶1。此條件下發(fā)酵的牦牛酸奶凝固均勻，組織結(jié)構(gòu)光滑細膩，無乳清析出，具有濃郁的酸奶風味。

2.2.6驗證實驗

按A3B4C2D2條件進行3次平行實驗，牦牛酸奶的滴定酸度平均值為108.32 °T，感官評分平均值為98，高于表8中每一項試驗結(jié)果，故A3B4C2D2為牦牛酸奶的最佳發(fā)酵工藝條件。

3 結(jié) 論

本實驗采用從西藏、川西青藏高原牧區(qū)自然發(fā)酵牦牛酸乳中篩選出的發(fā)酵性能優(yōu)良的4株乳酸桿菌（LP1、LP2、LP3、LP4）進行組合發(fā)酵實驗，利用紙片法對這4株菌之間協(xié)同的關(guān)系進行研究，確定出優(yōu)勢發(fā)酵組合分別為：Ⅰ（LP1和LP2）、Ⅱ（LP1和LP3）、Ⅲ（LP2和LP4）。通過分析優(yōu)勢組合發(fā)酵牦牛酸奶的凝乳時間、酸度、色澤、滋味和氣味、組織狀態(tài)可以得出Ⅰ組為本實驗的最佳發(fā)酵菌種組合。采用組合Ⅰ發(fā)酵牦牛酸奶，經(jīng)過正交試驗得出牦牛酸奶發(fā)酵的最佳工藝條件為：發(fā)酵溫度為42℃、接種量為6%、加糖量為4 g/100 mL、菌種LP1與LP2濃度比為2∶1。

因本實驗只對組合發(fā)酵的協(xié)同關(guān)系進行了研究，因此還需進一步研究兩株乳酸菌各自在牦牛酸奶發(fā)酵過程中發(fā)揮的作用。

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Screening of Dominant Lactic Acid Bacteria from Naturally Fermented Yak Milk in Tibetan Pastoral Areas and Optimization of Fermentation Conditions for Yak Yogurt Production

LIAO Yuting1, WU Jun1, LONG Mou1, DU Muying1,2,3,*, KAN Jianquan1,2,3
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400715, China; 3. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation (Chongqing), Ministry of Agriculture, Chongqing 400715, China)

FourLactobacillusstrains (LP1, LP2, LP3, and LP4) with excellent fermentation performance isolated from homemade yak yogurt samples collected in Tibetan plateau pastoral areas were used in combination to ferment yak yogurt. Using the disc diffusion method, the combination of LP1 and LP2 was screened as the best culture starter for the production of yak yogurt in terms of coagulation time, titratable acidity and sensory evaluation. The optimum fermentation parameters for yak yogurt were obtained through an orthogonal array design L16(44) as follows: fermentation temperature, 42℃; inoculum amount, 6%; sugar concentration, 4 g/100 mL; and LP1 to LP2 ratio, 2:1. Under these conditions, the fermented yak milk revealed even solidification, delicate and smooth texture, no whey separation and rich yogurt flavor.

yak yogurt; Lactobacillus; mixed-culture fermentation; process optimization

TS252.4

1002-6630（2015）11-0140-05

10.7506/spkx1002-6630-201511027

2014-07-02

中國-匈牙利政府間科技合作項目（國科外字[2013]83號）

廖鈺婷（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物與發(fā)酵工程。E-mail：paoer2006@aliyun.com

*通信作者：杜木英（1972—），女，副教授，博士，研究方向為食品微生物與發(fā)酵工程。E-mail：muyingdu@swu.edu.cn