ABCG2 mRNA的表達與乳腺癌蒽環(huán)類藥物化療效果的關系研究

徐象威 朱佩禎 張鵬海 陳銀巧 奚一源

乳腺癌是女性發(fā)病率最高且具有高度特異性、侵襲性的惡性腫瘤。2012年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球有近170萬女性被診斷為乳腺癌[1]。我國尚處于乳腺癌低發(fā)地區(qū)，是全球乳腺癌發(fā)病率最高國家（比利時）的 1/6，但自1998至2007年我國乳腺癌發(fā)病率增長1.2～2.8倍，且在過去30年中我國乳腺癌死亡率也增長了近1倍[2]?；煂τ谘娱L乳腺癌尤其是晚期乳腺癌患者生存時間具有重要意義。蒽環(huán)類藥物是乳腺癌化療中最常用的藥物，但由于個體的差異性，不同患者對蒽環(huán)類藥物的敏感性與耐藥性不同，臨床療效亦不同[3]。近年來腫瘤個體化治療成為醫(yī)學界關注的熱點，如能預測患者對蒽環(huán)類藥物化療的敏感性，選擇合適的化療方案，或可提高腫瘤治療的臨床效果。研究發(fā)現(xiàn)，三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白G2（ABCG2）與腫瘤化療耐藥、放療抵抗、激素治療不敏感等存在明顯關系[4-5]。ABCG2是多數(shù)化療藥物（拓撲異構酶抑制劑、蒽環(huán)類、喜樹堿類似物、酪氨酸激酶抑制劑及抗代謝藥物）的底物，可加速藥物從細胞內泵出，降低腫瘤細胞中有效藥物濃度[6]?；诖?，本研究通過分析乳腺癌患者蒽環(huán)類藥物化療前后ABCG2 mRNA的表達情況，探討其與化療效果的關系，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2012年6月至2013年12月本院腫瘤內科收治的乳腺癌根治術后接受蒽環(huán)類藥物化療的患者60例。納入標準：（1）經手術與病理學檢查確診為乳腺癌浸潤性導管癌者，經 CT、MRI證實具有1處或1處以上可測量的腫瘤病灶，根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟TNM分期進行分期；（2）心電圖和（或）左心室射血分數(shù)（LVEF）測定評分達標；（3）患者肝腎功能檢查正常，均能達到化療的基本要求，患者的身體狀況評分（ECOG評分）0～2分；（4）預計生存期＞3個月，功能狀態(tài)評分（KPS評分）≥60分；（5）初始治療方案為以蒽環(huán)類藥物為主的聯(lián)合化療，且至少化療4個周期。排除標準：（1）合并2種及以上原發(fā)惡性腫瘤；（2）妊娠期女性；（3）存在嚴重內分泌代謝及免疫疾病者。60例患者均為女性；其中年齡＞45歲36例，≤45歲24例；處于絕經狀態(tài)33例，未絕經狀態(tài)27例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ期21例，Ⅳ期14例；一般健康狀況評分（PS評分）0～1分 25例，2分35例。本研究經永康市第一人民醫(yī)院醫(yī)學倫理會審查且批準，患者均簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 化療方法與療效評判 患者入院后均給予標準的含蒽環(huán)類藥物聯(lián)合化療方案。包括：多西他賽/多柔比星/環(huán)磷酰胺（TAC）、多柔比星/環(huán)磷酰胺（AC）、多西他賽/環(huán)磷酰胺（TC）等?；颊呓邮?個周期化療后，通過腫瘤標志物、B超、胸部CT或MRI等檢查評判化療效果。療效評判標準參照實體腫瘤療效評判標準[7]，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、無變化（SD）、疾病進展（PD）。有效率=[（CR+PR）/（CR+PR+SD+PD）] ×100%，穩(wěn)定率=[（CR+PR+SD）/（CR+PR+SD+PD）] ×100%。根據(jù)腫瘤對含蒽環(huán)類藥物聯(lián)合化療的反應，將患者分為化療高反應患者與化療低反應患者?；颊弑憩F(xiàn)為經蒽環(huán)類藥物化療后呈CR或PR視為高反應，而化療后SD或PD視為低反應。

1.2.2 ABCG2 mRNA表達水平檢測 （1）樣本采集：采集患者初次化療前、化療4個周期后的肘靜脈血5ml，標注患者信息與采血時間。（2）采用RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒（天根生化有限公司，批號：Q5704）提取總RNA，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。（3）將提取出的總RNA通過逆轉錄試劑盒（Thermo Fermentas公司，批號：00314956）合成cDNA產物，置于-20℃保存待測。（4）取上述所獲得的cDNA，采用實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測化療前后ABCG2 mRNA表達水平。提取出的cDNA通過引物（上游：5′-GCGCAAGCTTATGTCTTCCAGTAATGTCGAA-3′；下游：5′-GCGCTCTAGATTAAGGGGAAATTTAAGAATA-3′）擴增目的基因。此后按照KAPA SYBR?FAST Real-time PCR Ki（tKAPA公司，批號：KK4601）的反應體系加入試劑在ABI 7300 qPCR儀進行實時熒光定量完成ABCG2 mRNA表達水平檢測。以β-actin為內參，采用相對定量法（ΔΔCt）對實時熒光定量PCR產物進行比較。ΔCt=Ct均值（目的基因）-Ct均值（管家基因）；ΔΔCt=實驗組ΔCt-對照組 ΔCt；以 2-ΔΔCt計算 mRNA 表達水平的差異。

1.2.3 預后情況觀察 患者均進行為期5年的隨訪，主要通過電話隨訪、門診或住院病歷系統(tǒng)查詢等方式，統(tǒng)計預后情況。主要觀察終點為疾病無進展生存，疾病無進展生存期指自首次化療后至隨訪終止或疾病復發(fā)或轉移的時間，主要通過醫(yī)院信息系統(tǒng)或患者直系親屬電話確認，末次隨訪時間截止2018年12月?；颊咴诨煰煶探Y束后每2個月隨訪1次以評估生存期。

1.3 觀察指標 （1）觀察患者化療效果；（2）比較化療高反應患者與化療低反應患者臨床特征，包括年齡、月經狀況、臨床分期、PS評分等；（3）比較化療高反應患者與化療低反應患者化療前后ABCG2 mRNA表達水平；（4）分析乳腺癌患者化療后ABCG2 mRNA表達水平與疾病無進展生存期的關系。以患者化療后ABCG2 mRNA表達水平中位數(shù)為界，分為ABCG2 mRNA高表達（表達水平≥中位數(shù)）患者與低表達（表達水平＜中位數(shù)）患者，比較ABCG2 mRNA高表達患者與低表達患者疾病無進展期。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，組內化療前后比較采用配對t檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)和構成比表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制疾病無進展生存曲線，疾病無進展生存期的比較采用Wilcoxon秩和檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者化療效果 60例患者經過4個周期的化療后，CR 9例，PR 28例，SD 18例，PD 5例；治療有效率為61.7%，穩(wěn)定率為91.7%。化療高反應患者37例、低反應患者23例。

2.2 化療高反應患者與化療低反應患者臨床特征比較 見表1。

表1 化療高反應患者與化療低反應患者臨床特征比較[例（%）]

由表1可見，化療高反應患者與化療低反應患者年齡、月經狀況、臨床分期、PS評分等比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.3 化療高反應患者與化療低反應患者化療前后ABCG2 mRNA表達水平比較 見表2。

表2 化療高反應患者與化療低反應患者化療前后ABCG2 mRNA表達水平比較

由表2可見，組間比較，化療前，化療高反應患者與化療低反應患者ABCG2 mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；化療后，化療后高反應患者ABCG2 mRNA表達水平低于化療低反應患者（P＜0.05）。組內比較，化療高反應患者化療后ABCG2 mRNA低于化療前（P＜0.05），而化療低反應患者化療后ABCG2 mRNA表達水平高于化療前（P＜0.05）。

2.4 乳腺癌患者化療后ABCG2 mRNA表達水平與疾病無進展生存期的關系分析 本研究60例患者化療后ABCG2 mRNA表達水平中位數(shù)為1.24，ABCG2 mRNA高表達（表達水平≥1.24）患者與低表達（表達水平＜1.24）患者疾病無進展生存曲線見圖1。

由圖1可見，ABCG2 mRNA高表達患者與低表達患者中位疾病無進展生存期分別為47個月與54個月，ABCG2 mRNA低表達患者疾病無進展生存期長于高表達患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 ABCG2 mRNA高表達患者與低表達患者疾病無進展生存曲線比較

3 討論

蒽環(huán)類藥物作為乳腺癌化療方案中最常用的藥物之一，無論在乳腺癌術前新輔助治療、復發(fā)轉移解救治療還是在晚期乳腺癌輔助治療中都有非常重要的作用。但腫瘤細胞對產生化療藥物耐受性是影響化療效果及患者預后的首要原因，約90%的轉移性乳腺癌患者化療失敗歸咎于多藥耐藥（MDR）。研究認為，ABC轉運體在乳腺癌細胞中的過度表達是造成MDR最常見的一種機制[8]。ABCG2是ABC超家族中ABC-G亞家族的第2個成員，因其首先在乳腺癌耐藥株（MCF-7/AdrVp）中被發(fā)現(xiàn)，亦稱為乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）[9]。ABCG2/BCRP是一種ATP依賴性轉運體，以同源或異源二聚體來發(fā)揮ATP依賴性藥物外排轉運體的作用，利用ATP水解產生的能量降低細胞內藥物或內源性及外源性細胞毒藥物濃度，產生特殊的藥物耐藥性[10]。

當前有研究報道稱，在乳腺浸潤性導管癌、食管癌、纖維肉瘤和多發(fā)性骨髓瘤等的耐藥細胞株中ABCG2均存在過度表達，ABCG2蛋白在乳腺癌組織中陽性表達率、表達水平均明顯高于癌旁組織[11-12]。Qu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與化療前相比，化療后的殘存乳腺癌細胞膜上ABCG2呈高表達，這說明化療后乳腺耐藥相關蛋白的表達上調。王飛通等[14]發(fā)現(xiàn)，SW1990細胞經過吉西他濱處理后，增殖能力明顯受抑制，呈時間依賴性減弱，而SW1990細胞中ABCG2蛋白與mRNA的表達成時間依賴性的升高，表明吉西他濱誘導ABCG2基因表達上調是造成腫瘤細胞逃避細胞毒藥物殺傷的機制之一。本研究結果顯示，化療高反應患者ABCG2 mRNA表達水平均較化療前降低，而化療低反應患者較化療前升高。這說明乳腺癌化療效果與患者ABCG2 mRNA表達水平呈負相關。這與Marzac等[15]的研究結果相似，其對急性髓細胞白血病患者規(guī)范化療后的隨訪發(fā)現(xiàn)，患者高表達ABCG2與完全緩解率、耐藥率和總生存率有顯著的相關性。分析可能原因，腫瘤患者化療后ABCG2基因的表達上調，當達到一定程度時發(fā)揮外排泵功能，將進入細胞內的化療藥物逆濃度梯度的轉運到細胞膜外，從而降低細胞內藥物濃度，促使一些腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性，從而影響化療效果。

ABCG2的表達與患者預后的關系研究已有報道。Ota等[16]發(fā)現(xiàn)經鉑類藥物化療的非小細胞肺癌患者的生存期較短，這與ABCG2的過表達有關，多因素分析顯示ABCG2的表達是影響疾病無進展生存期的獨立因素。何建明等[17]發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌ABCG2陽性表達患者的生存期與累計生存率均明顯低于ABCG2陰性者，ABCG2陽性表達率越高，其預后越差。本研究結果顯示，ABCG2 mRNA表達水平與乳腺癌患者疾病無進展生存期有關，ABCG2 mRNA低表達患者疾病無進展生存期高于高表達患者；且化療高反應患者疾病無進展生存期亦長于化療低反應患者。

綜上所述，乳腺癌患者接受蒽環(huán)類藥物化療后，ABCG2 mRNA低表達患者其外排蒽環(huán)類藥物能力弱于高表達的患者，可使腫瘤細胞內藥物保持在有效治療濃度，患者化療效果較好，且疾病無進展生存時間較長，預后較好。蒽環(huán)類藥物可誘導乳腺癌患者ABCG2 mRNA表達的改變，檢測其表達水平對于判斷乳腺癌患者化療效果與預后具有一定的參考價值。