MTHFB C677T基因、血清同型半胱氨酸與特發(fā)性男性不育癥的關(guān)系研究

邵麗佳 朱德勝 陳偉 沈利洪

隨著人類基因組計(jì)劃順利完成及男科學(xué)研究迅速發(fā)展，與特發(fā)性男性不育癥相關(guān)的基因逐步被發(fā)現(xiàn)，其中亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因677位點(diǎn)的單核苷酸突變與男性不育的發(fā)生有關(guān)[1-4]，該過(guò)程可能是由于MTHFR基因位點(diǎn)突變導(dǎo)致高同型半胱氨酸（Hcy）血癥，從而導(dǎo)致男性不育[5]。但MTHFR基因與血清Hcy水平之間的關(guān)系目前尚缺乏驗(yàn)證，且高Hcy血癥與男性不育之間的關(guān)系尚存在爭(zhēng)議?；诖?，本研究通過(guò)檢測(cè)特發(fā)性男性不育癥患者M(jìn)THFR C677T基因型和血清Hcy水平，分析MTHFR C677T基因多態(tài)性、血清Hcy水平與特發(fā)性男性不育癥的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2017年4月至2018年9月本院收治的特發(fā)性男性不育癥患者167例，設(shè)為病例組，納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡20～39歲，夫婦婚后同居至少1年、正常性生活未避孕未育、排除女方不孕，無(wú)特殊既往史和家族史；排除染色體核型異常，Y染色體無(wú)精癥因子區(qū)微缺失，精索靜脈曲張，隱睪，附睪損傷，阻塞性無(wú)精癥，生殖系統(tǒng)感染。另?yè)裢趤?lái)院體檢，有正常生育史且身體健康者65例，設(shè)為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡20～39歲，至少生育過(guò)1個(gè)孩子，身體健康，無(wú)特殊既往史和家族史；排除通過(guò)輔助生殖技術(shù)生育子女者。病例組患者年齡20～39（29.4±3.1）歲，對(duì)照組受檢者年齡 21～39（28.8±2.8）歲，兩組年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)金華市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有受檢者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 精液質(zhì)量分析 依據(jù)WHO第五版《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室檢查手冊(cè)》，采用CASA計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)，對(duì)病例組患者行精液質(zhì)量分析。精液質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)包括精子總數(shù)、精子活力和精子形態(tài)，其中精子總數(shù)≤39×106/每次射精為精子總數(shù)異常，前向精子運(yùn)動(dòng)率≤32%為精子活力異常，正常形態(tài)精子≤4%為精子形態(tài)異常。根據(jù)精液質(zhì)量將特發(fā)性男性不育癥分為8個(gè)亞型：精液質(zhì)量正常型，僅精子總數(shù)異常為少精子癥，僅精子活力異常為弱精子癥，僅精子形態(tài)異常為畸精子癥，精子總數(shù)和精子活力異常為少弱精子癥，精子總數(shù)和精子形態(tài)異常為少畸精子癥，精子活力和精子形態(tài)異常為弱畸精子癥，精子總數(shù)、精子活力及精子形態(tài)均異常為少弱畸精子癥。

1.2.2MTHFR C677T基因型檢測(cè) 采用RT-PCR法。抽取病例組患者與對(duì)照組受檢者2 ml全血至EDTA抗凝試管中，充分混勻后使用北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒抽提全血DNA。使用上海之江生物有限公司生產(chǎn)的MTHFR C677TMutation Real Time PCR Kit試劑盒進(jìn)行MTHFR C677T基因多態(tài)性檢測(cè)。制作反應(yīng)體系為40μl。循環(huán)參數(shù)：37℃ 2min，94℃ 2min，循環(huán) 1 次；93℃10s，62℃40s，循環(huán)30次。4℃終止。信號(hào)收集在62℃。熒光檢測(cè)通道為FAM和VIC。FAM通道陰性、VIC通道陽(yáng)性為野生型（CC型），F(xiàn)AM通道和VIC通道均陽(yáng)性為突變雜合子（CT型），F(xiàn)AM通道陽(yáng)性、VIC通道陰性為突變純合子（TT型）。

1.2.3 血清Hcy水平檢測(cè) 抽取病例組患者與對(duì)照組受檢者空腹靜脈血2ml，用促凝真空管留置靜脈血標(biāo)本，血液凝固后以3 500 r/min離心，使用奧林帕斯AU 5400生化全自動(dòng)分析儀檢測(cè)血清Hcy水平。血清Hcy水平≤15μmol/L定義為正常Hcy，血清Hcy水平＞15μmol/L定義為高Hcy血癥。

1.3 觀察指標(biāo) （1）觀察病例組患者精液質(zhì)量分析結(jié)果；（2）比較兩組對(duì)象MTHFR C677T基因型；（3）比較兩組血清Hcy水平；（4）比較不同MTHFR C677T基因型的兩組血清Hcy水平；（5）單因素分析MTHFR C677T基因型與特發(fā)性男性不育癥的關(guān)系；（6）單因素分析血清Hcy水平與特發(fā)性男性不育癥的關(guān)系；（7）多因素分析MTHFR C677T基因型、血清Hcy水平與特發(fā)性男性不育癥的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件；正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較用Kruskal-WallisH秩和檢驗(yàn)，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，組內(nèi)同一指標(biāo)比較用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，兩組比較采用χ2檢驗(yàn)，組內(nèi)同一指標(biāo)兩兩比較采用Bonferroni方法進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正；采用logistic回歸分析MTHFR C677T基因型、血清Hcy水平與特發(fā)性男性不育癥的關(guān)系；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例組患者精液質(zhì)量分析結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 病例組患者精液質(zhì)量分析結(jié)果[例（%）]

由表1可見(jiàn)，病例組患者中精液質(zhì)量正常型13例、少精子癥2例、弱精子癥37例、畸精子癥15例、少弱精子癥14例、少畸精子癥3例、弱畸精子癥62例、少弱畸精子癥21例。

2.2 兩組對(duì)象MTHFR C677T基因型比較 見(jiàn)表2。

表2 兩組對(duì)象MTHFR C677T基因型比較[例（%）]

由表2可見(jiàn)，兩組對(duì)象MTHFR C677T基因型分布情況存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），病例組患者TT基因型比例高于對(duì)照組。兩組對(duì)象MTHFR C677T基因的等位基因分布情況存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），病例組患者T等位基因頻率高于對(duì)照組。

2.3 兩組對(duì)象血清Hcy水平比較 病例組患者血清Hcy 水平為 13.8（10.4，18.4）μmol/L，對(duì)照組受檢者血清Hcy 水平為 11.1（9.9，12.4）μmol/L。兩組對(duì)象血清 Hcy水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），病例組患者血清Hcy水平高于對(duì)照組受檢者。

2.4 不同MTHFR C677T基因型的兩組對(duì)象血清Hcy水平比較 見(jiàn)表3。

表3 不同MTHFR C677T基因型的兩組對(duì)象血清Hcy水平比較（μmol/L）

由表3可見(jiàn)，不同MTHFR C677T基因型的對(duì)照組受檢者間血清Hcy水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同MTHFR C677T基因型的病例組患者血清Hcy水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不同基因型患者血清Hcy水平兩兩比較，TT基因型的病例組患者血清Hcy水平高于CC基因型的病例組患者，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5MTHFR C677T基因型與特發(fā)性男性不育癥的關(guān)系分析 見(jiàn)表4。

表4 MTHFR C677T基因型與特發(fā)性男性不育癥的關(guān)系分析

由表4可見(jiàn)，CT基因型的研究對(duì)象（包括病例組患者與對(duì)照組受檢者）患特發(fā)性男性不育癥的風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型的1.46倍，但這一關(guān)系無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（95%CI:0.78～2.74，P＞0.05），而 TT基因型的研究對(duì)象患特發(fā)性男性不育癥的風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型的3.63倍（95%CI：1.45～9.06，P＜0.05）。

2.6 血清Hcy水平與特發(fā)性男性不育癥的關(guān)系分析見(jiàn)表5。

表5 血清Hcy水平與特發(fā)性男性不育癥的關(guān)系分析

由表5可見(jiàn)，高Hcy血癥者患特發(fā)性男性不育癥的風(fēng)險(xiǎn)是非高Hcy血癥者的24.46倍（95%CI：5.79～103.31，P＜0.05）。

2.7MTHFR C677T基因型、血清Hcy水平與特發(fā)性男性不育癥的關(guān)系分析 見(jiàn)表6。

表6 MTHFR C677T基因型、血清Hcy水平與特發(fā)性男性不育癥的關(guān)系分析

由表6可見(jiàn)，CT、TT基因型研究對(duì)象與CC基因型相比，其特發(fā)性男性不育癥的患病風(fēng)險(xiǎn)增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；高Hcy血癥仍然是特發(fā)性男性不育癥患病風(fēng)險(xiǎn)增大的危險(xiǎn)因素，OR=22.38（95%CI：5.27～95.128，P＜0.05）。

3 討論

MTHFR是一種黃素依賴酶，相對(duì)分子量為74.5kD，在機(jī)體中主要介導(dǎo)5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)變成5-甲基四氫葉酸，后者在DNA和蛋白質(zhì)甲基化的甲基供體S-腺苷甲硫氨酸的形成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。目前，人類基因組研究已發(fā)現(xiàn)MTHFR基因存在多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中MTHFR C677T為CC型、CT型和TT型，MTHFR的酶活性依次下降[7-8]。

Hcy是一種含硫氨基酸，可在N5-甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶及其輔酶維生素B12的作用下生成蛋氨酸，也可在胱硫醚-β-合成酶的催化下生成半胱氨酸。Hcy再甲基化時(shí)由5-甲基四氫葉酸提供甲基，而MTHFR正是介導(dǎo)5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)變成5-甲基四氫葉酸的關(guān)鍵酶。

據(jù)中國(guó)、德國(guó)、印度等多個(gè)國(guó)家的研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與當(dāng)?shù)厝巳旱哪行圆挥l(fā)生存在關(guān)系[1-4]。有學(xué)者提出，MTHFR C677T位點(diǎn)的突變導(dǎo)致MTHFR基因出現(xiàn)異常，可能引起血液中Hcy的堆積形成高Hcy血癥，高Hcy血癥會(huì)導(dǎo)致男性不育[5]。本研究結(jié)果顯示，病例組患者TT基因型比例高于對(duì)照組，且病例組患者T等位基因頻率高于對(duì)照組。這說(shuō)明T等位基因可能是特發(fā)性男性不育癥的危險(xiǎn)等位基因，這一結(jié)果與既往研究結(jié)果相符[9-10]。

血清Hcy水平與特發(fā)性男性不育癥之間的關(guān)系尚無(wú)定論。趙銘佳等[11]的研究發(fā)現(xiàn)血清Hcy水平與男性精液量、精子濃度和精子活力均無(wú)關(guān)系，但戈一峰等[12]、何海洪等[13]的研究提示血清Hcy水平與精子濃度、精子活力均呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，病例組患者血清Hcy水平高于對(duì)照組受檢者。

本研究中，不同MTHFR C677T基因型的對(duì)照組受檢者間血清Hcy水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將MTHFR C677T基因、血清Hcy水平分別與特發(fā)性男性不育進(jìn)行單因素logistic回歸分析，結(jié)果分別肯定了這兩個(gè)因素與疾病的關(guān)聯(lián)，但是在多因素logistic回歸分析中，高Hcy血癥仍然是特發(fā)性男性不育癥患病的危險(xiǎn)因素，而MTHFR C677T基因與患病之間的關(guān)系沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果提示，MTHFR C677T基因?qū)ρ錒cy水平的影響可能很有限，血清Hcy水平可能受多種因素調(diào)節(jié)，而真正影響特發(fā)性男性不育癥的因素更可能是多種因素導(dǎo)致的高Hcy血癥，而非MTHFR C677T基因多態(tài)性。即血清Hcy水平可能是獨(dú)立于MTHFR C677T基因的影響特發(fā)性男性不育癥的因素，且高Hcy血癥者的特發(fā)性男性不育癥患病風(fēng)險(xiǎn)是非高Hcy血癥者的22.38倍。

血清Hcy水平影響特發(fā)性男性不育癥發(fā)生的機(jī)制可能是體內(nèi)高Hcy可抑制谷胱甘肽合成，谷胱甘肽為活性氧的清除物質(zhì)，當(dāng)谷胱甘肽減少時(shí)，精液中活性氧產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，造成精子生成減少、精子DNA損傷等，最終導(dǎo)致精液質(zhì)量降低[14]；此外高Hcy血癥可能引起睪丸中的血管過(guò)早發(fā)生動(dòng)脈硬化，影響睪丸的血液供應(yīng)，導(dǎo)致生精功能障礙[15]。

綜上所述，MTHFR C677T基因的T等位基因、高Hcy血癥均是特發(fā)性男性不育癥發(fā)病的危險(xiǎn)因素，而血清Hcy水平可能是獨(dú)立于MTHFR C677T基因的影響特發(fā)性男性不育癥發(fā)病的因素。在常規(guī)生育前體檢、不育男性檢查中增加血清Hcy水平檢測(cè)可能對(duì)特發(fā)性男性不育癥的病因發(fā)現(xiàn)和治療、實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育有重要的現(xiàn)實(shí)意義。