IGF-2在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義

金銀 姜亦珍 桂琦

結(jié)直腸癌是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1]。而胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系密切，近年來引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注。目前有研究提到IGF-2可作為多種腫瘤的預后分子標志物[2]。本文對IGF-2在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義進行分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取本院2017年1月至2018年5月確診為結(jié)直腸癌的79例患者，其中男50例，女29例；年齡33～81（64.36±8.95）歲；直腸癌 58 例，結(jié)腸癌 21 例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，伴有遠處轉(zhuǎn)移13例，無淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移36例；TNM分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期20例，Ⅲ期17例，Ⅳ期19例。入選標準：（1）經(jīng)病理學檢查確診為結(jié)直腸癌；（2）未行手術(shù)、放化療；（3）病理類型為腺癌。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）合并嚴重心肺疾病；（3）合并克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎等其他腸道疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過，所有患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 組織標本獲取 將術(shù)中獲取的結(jié)直腸癌組織切成0.5cm左右的小塊，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 結(jié)直腸癌組織中IGF-2 mRNA表達的檢測 采用qRT-PCR法。將結(jié)直腸癌組織標本56℃液化1h，提取總RNA；取5μl總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測其完整性。逆轉(zhuǎn)錄按照BIOMIGA公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，-80℃保存?zhèn)溆?。按照美國BIOMIGA公司的SYBR GreenⅠ說明書配制qRT-PCR反應體系，取cDNA進行qRT-PCR。反應條件：95℃預變性10min；95℃ 15s，60℃ 1min，共40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個復孔。以GAPDH作為內(nèi)參基因，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。GAPDH引物：正向5′-GAAAAGAAGGACCCCAGAA-3′，反向 5′-TGCTGTGTGTTGTGTGTGTC-3′。IGF-2 引物：正向 5′-CTTGGACTTTGAGTCAAATTGG-3′，反向 5′-GGTCGTGCCAA TTACATTTCA-3′。2-ΔΔCt表示樣品中目的基因相對表達量，其中ΔCt=樣本Ct均值-內(nèi)參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-（隨機陰性對照樣品Ct均值-該樣品內(nèi)參Ct均值）。

1.2.3 結(jié)直腸癌組織中IGF-2蛋白表達的檢測 采用免疫組化染色法。對結(jié)直腸癌組織標本進行固定、浸泡、浸蠟、包埋、切片、脫蠟處理，并將其浸泡于3%雙氧水中20min。PBS沖洗組織切片3次以上（＞15min），再將700ml檸檬酸緩沖液（pH6.0）放入燒杯加熱；當檸檬酸緩沖液沸騰后，將組織切片置入燒杯內(nèi)；15min后將組織切片取出，在常溫下冷卻5min，PBS（pH 7.4）沖洗3次以上（＞15 min）。對組織切片進行一抗處理，并置于4℃冰箱孵育；第2天取出組織切片，PBS（pH 7.4）再次沖洗。對組織切片進行二抗處理，然后常溫孵育10min，使用PBS（pH 7.4）進行沖洗。使用二氨基聯(lián)苯胺顯色溶液對組織切片進行顯色處理，再用清水進行沖洗；用蘇木精對組織切片進行襯染，透明脫水樹膠進行封固；染色完成后，在光學顯微鏡下觀察組織切片。IGF-2蛋白表達結(jié)果的判定[3]：染色強度無色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞所占比例≤1%為0分，＞1%～10%為1分，＞10%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分；染色強度分值與陽性細胞所占比例分值的乘積＜3分為陰性，3～4分為弱陽性，5分為中等陽性，≥6分為強陽性。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗或單因素方差分析；等級資料的比較采用Mann-WhitneyU檢驗或Kruskal-WallisH檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織中IGF-2 mRNA表達與患者臨床特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌中IGF-2 mRNA表達與TMN分期有關(guān)，即分期越高，mRNA相對表達量越高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；結(jié)直腸癌中IGF-2 mRNA表達與患者年齡、性別、BMI、腫瘤部位均無關(guān)，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 結(jié)直腸癌組織中IGF-2 mRNA表達與患者臨床特征的關(guān)系

2.2 結(jié)直腸癌組織中IGF-2蛋白表達與臨床特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中IGF-2蛋白表達與TMN分期有關(guān)，即分期越高，蛋白表達越強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；結(jié)直腸癌組織中IGF-2蛋白表達與患者年齡、性別、BMI、腫瘤部位均無關(guān)，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表 2。

表2 結(jié)直腸癌組織中IGF-2蛋白表達與患者臨床特征的關(guān)系（例）

3 討論

目前關(guān)于結(jié)直腸癌的病因不明，其相關(guān)危險因素有吸煙、飲酒、高脂肪低纖維飲食、加工紅肉或酒精的微生物代謝物介導的腸道菌群改變等[3-5]。結(jié)直腸癌是一種可能涉及到多個步驟、多個階段及多個基因共同參與的細胞遺傳學疾病；在細胞發(fā)生癌變過程中，逐漸發(fā)生基因突變和癌變[6-7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胰島素、IGF參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[8-11]。IGF是一類多肽激素，具有與胰島素類似的功能和結(jié)構(gòu)[12]。IGF-2是IGF家族中調(diào)節(jié)生長發(fā)育的多肽生長因子之一，在發(fā)育過程中通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和翻譯機制微妙地控制其表達[13]。它是一種7.5KDa的有絲分裂肽激素，主要由肝臟產(chǎn)生，也可自分泌或由旁分泌的組織分泌[14]；它也是胎兒發(fā)育的主要生長因子，其mRNA表達在腎、肝組織中均有下調(diào)，而通常在癌組織中過表達[14]。

體外實驗表明，IGF-2 mRNA一般由乳腺癌成纖維細胞表達，外源性IGF-2可支持人乳腺癌細胞在無血清、無雌激素培養(yǎng)基中旺盛生長[12]。原位雜交研究表明，在乳腺癌中IGF-2 mRNA完全由惡性腫瘤間質(zhì)表達，與IGF-2蛋白染色密切相關(guān)[12]；該研究還表明，IGF-2蛋白在大多數(shù)腫瘤的上皮和間質(zhì)中表達，IGF-2在乳腺癌中的表達與乳腺癌生長與分化的2個重要調(diào)控因子有關(guān)[12]。IGF-2過表達發(fā)生在多數(shù)肉瘤中，常伴IGF-2位點印跡丟失；約50%的子宮平滑肌肉瘤IGF-2高表達，對于腫瘤上皮間室IGF-2表達水平高于本研究隊列中值的患者，其疾病進展或死亡風險約增加1倍[15]。在上皮性卵巢癌和其他癌癥中，胎兒IGF-2啟動子的重新激活和IGF-2過表達與預后惡化有關(guān)[15]。

本研究結(jié)果顯示，不同年齡、性別、BMI、腫瘤部位的結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中IGF-2 mRNA及蛋白表達比較，差異均無統(tǒng)計學意義；但是TMN分期越高，結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中IGF-2 mRNA及蛋白表達越強。實驗表明，IGF-1、IGF-1R、IGF-2R、IGF-2 的表達涉及某些腫瘤的分化和轉(zhuǎn)移，提示分期越高，相對表達量越高。Liu等[16]研究表明，miRNA-30a通過下調(diào)IGF-1R抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。IGF-2具有促進細胞有絲分裂、刺激細胞增殖及DNA復制和轉(zhuǎn)錄、刺激組織器官生長和分化等作用，IGF-2的促細胞增殖作用不僅體現(xiàn)在正常細胞，也可以通過旁分泌或自分泌方式促進腫瘤細胞的增殖[17]。張德芳[18]研究表明，IGF-2及IGF結(jié)合蛋白的表達可能與結(jié)腸癌患者的腫瘤分期、臨床上常規(guī)腫瘤標志物存在一定的聯(lián)系。高表達的miR-483-5p能通過上調(diào)IGF-2基因p3 mRNA轉(zhuǎn)錄，以促進肝癌細胞的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，本研究認為IGF-2可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，可為作為預測結(jié)直腸癌的一項參考指標。