紫花苜蓿半胱氨酸合酶基因MsSDCS-0植物GFP熒光表達載體構建與擬南芥轉化

趙菲佚，馬家琦，安建平，焦成瑾，馬偉超

（天水師范學院 生物工程與技術學院，甘肅 天水 741001）

紫花苜蓿（Medicago savita）屬豆科苜蓿多年生草本植物，素有“牧草之王”和“飼料皇后”的美稱。[1]苜蓿有極高的營養(yǎng)價值，[2]是世界上最重要的牧草之一，廣泛分布于全世界，對牛、羊等牲畜的生長具有重要的作用。[3]

硫在動物所需的營養(yǎng)中占有重要地位，對促進家畜的生長和發(fā)育以及家畜產品的質量和生產具有極其重要的意義。在苜蓿品質指標中，含硫氨基酸含量為重要的指標之一。[4]苜蓿雖富含高量蛋白，但氨基酸組成不平衡，含硫氨基酸[半胱氨酸（Cys）和甲硫氨酸（Met）]含量很低，而Cys和Met是人畜的必需氨基酸，長期食用低硫含量的飼料會引起牛羊的脫毛，降低皮毛質量，蛋奶質量以及影響對其他氨基酸的吸收。因此提高苜蓿含量中含硫氨基酸的含量在牧草生產中具有重要的意義。

半胱氨酸是植物合成的第一個有機硫化物，其合成調控很可能是提高植物含硫氨基酸的關鍵點，因而，半胱氨酸合成酶(CSase)在植物含硫氨基酸代謝中起著關鍵的作用。CSase是由多成員組成的小家族。目前，已經從擬南芥、水稻、大豆、截形苜蓿、鷹嘴豆等植物中克隆得到OAS-TL基因，部分基因已成功轉入擬南芥等模式植物[5]，通過基因工程的手段從紫花苜蓿本身克隆到OAS-TL的基因，然后再將其轉入紫花苜蓿，提高OAS-TL的表達量，從而提高體外無機硫轉化為體內有機硫的效率，進而增加紫花苜蓿的硫含量。

本研究將紫花苜蓿三得利（Sanditi）半胱氨酸合成酶基因成員MsSDCS-0序列從克隆載體pBSC亞克隆至pCAMBIA1205植物表達載體上，成功構建植物熒光表達載體pCAMBIA1205-GFPn-MsS?DCS-0，轉入野生型（Col-0）擬南芥原生質體考察半胱氨酸合成酶MsSDCS-0成員亞細胞定位，并同時轉化擬南芥整體植物以考察其表達模式。為該基因成員在植物含硫氨基酸代謝中功能與應用后續(xù)研究提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1植物材料

擬南芥野生型(Col-0)為本實驗室保存。

1.1.2實驗菌株與載體

大腸桿菌E.coliDH5α與含pBSC-MsSDCS-0克隆載體DH5α菌株、農桿菌GV3101、熒光表達載體pCAMBIA1205-GFPn均為本實驗室保存。

1.1.3菌落PCR引物

含陽性植物熒光GFP表達載體的GV3101農桿菌菌落PCR鑒定引物序列如表1，由上海生物工程公司合成。

表1 菌落PCR鑒定用引物序列

1.1 試劑與儀器

1.2.1主要試劑

SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、San?Prep柱式DNA膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶試劑盒、Taq DNA聚合酶等購自上海生物工程股份有限責任公司。限制性內切酶Bam HⅠ和SalⅠ等均購自Takara公司。

1.2.2主要儀器

梯度PCR儀（Eppendorf，6321A），凝膠成像系統(tǒng)（UVP，GelDoc-it2），激光共聚焦顯微鏡（Con?focal）(Zeiss，META-510)。

1.3 試驗方法

1.3.1MsSDCS-0基因植物表達載體的構建

克隆載體pBSC-MsSDCS-0及植物熒光表達載體pCAMBIA1205-GFPn的工程菌培養(yǎng)與質粒提取按試劑盒產品指導進行。使用Bam HⅠ和SalⅠ對目標質粒進行雙酶切，酶切體系建立及酶切反應結果確認均按標準分子操作進行[6]。

1.3.2 pCAMBIA1205-GFPn-MsSDCS-0重組質粒轉化GV3101與陽性菌落鑒定

取3μl構建成功的pCAMBIA1205-GFPn-MsS?DCS-0重組質粒轉化至GV3101感受態(tài)細胞中，轉化過程使用凍融法進行。轉化細胞涂布于含Chl（30mg/L），Rif（50mg/L）和Gent（25mg/L）抗性的LB平板上，28℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取單菌落作為模板PCR驗證，篩選陽性克隆。PCR反應條件為94℃預變性10min，94℃變性10 s，58.5℃退火30 s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸7min.使用正向引物為35SF，反向引物MsSDCS-0R進行PCR擴增。擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認陽性克隆后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 pCAMBIA1205-GFPn-MsSDCS-0重組質粒擬南芥原生質體瞬時表達

使用生長在短日照條件下，大約3～4周未開花植物，取第2～4對葉片，用鋒利的刀片去掉葉片的尖部和尾部，把中間部分切成0.5～1mm的長條。將10～20個葉片的切片溶于裝5～10ml的W 5溶液（1.25%celluase R10，0.3%mace-rozyme R10，0.4 Mmannitol，20mM KCl，20mMMES，pH 5.7，10 mM CaCl2，0.1%BSA，0.45μm濾膜過濾，溶液呈透明橙色）燒杯中。用30～75μm(200目)的尼龍膜過濾含有原生質體的W 5溶液置于50m l的離心管中。100 g，lmin離心沉淀原生質體，去上清。在PEG轉化前用適量的MMg溶液（0.4 Mmannito，15mMMgCl2，4mMMES，pH 5.7)懸浮原生質體(1-2x105/m l)。

30μg質粒DNA加入200μl原生質體(4x104)放入離心管中，混勻，勿上下顛倒，防止原生質體破碎。加220μl PEG溶液（4 g PEG4000，3m l H2O，2.5 ml 0.8 M mannitol，1 ml 1 M CaCl2)，混勻，23℃孵育5～30min.每次處理6個樣品，加0.8ml W5溶液，混勻，10 g，lmin，離心去除PEG，先用100μlW 5懸浮原生質體，再加W5至1m l.液體放在24孔板上23℃孵育，24 h后在Confocal下進行熒光亞細胞定位觀察。

1.3.4植物GFP熒光表達載體的擬南芥轉化

植物轉化方法采用農桿菌浸蘸法，[7]擬轉化農桿菌GV3101菌株在含Chl（30mg/L），Rif（50mg/L）和Gent（25mg/L）抗性的5ml LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，次日轉接于200ml與上述小量培養(yǎng)液相同的LB培養(yǎng)基中，當菌液的OD600至0.8～1.0時，5000 rpm常溫離心10min收集菌體，菌體沉淀重懸浮于等體積（200ml）MSB培養(yǎng)基（每L含MS 2.2 g、蔗糖50 g、silwet L-77 200μl、6-BA 200μl）中，挑選處于開花期、生長良好的野生型擬南芥Col-0，在含目的載體質粒的GV3103的轉化液中轉化2min后，用保鮮膜包裹，分別做好標記，水平放置于培養(yǎng)盤中暗中培養(yǎng)24 h，后置于正常生長條件下繼續(xù)生長。T1代種子分別用于表型觀察和熒光觀察。

2 結果與分析

2.1 MsSDCS-0基因植物GFP熒光表達載體構建

pBSC-MsSDCS-0及pCAMBIA1205-GFPn質粒經Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切、膠回收后，使用T4 DNA連接酶將MsSDCS-0片段與pCAMBIA1205-GFPn酶切后載體進行連接，并轉化DH5α感受態(tài)細胞中。在含Chl抗性的LB平板上篩選陽性克隆。挑取單個陽性克隆菌落于LB/Chl培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)。質粒提取質量如圖1A所示，用Bam HⅠ和SalⅠ對所構建重組質粒載體進行雙酶切驗證，電泳結果如圖1 B所示。并將該重組質粒載體被命名為pCAM?BIA1205-GFPn-MsSDCS-0.

圖1 重組質粒pCAMBIA1205-GFPn-MsSDCS-0質粒提取與酶切驗證

電泳檢測結果顯示：重組質粒載體pCAM?BIA1205-GFPn-MsSDCS-0經Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切后可釋放出2個片段，其分別為目的基因MsS?DCS-0片段及pCAMBIA1205-GFPn載體骨架片段，條帶表現(xiàn)清晰，分別為～970bp和～10Kb，且符合預期大小。表明MsSDCS-0已成功構建到植物熒光表達載體pCAMBIA1205-GFPn上，可用于擬南芥原生質體轉化及農桿菌GV3101的轉化。

2.2 pCAMBIA1205-GFPn-MsSDCS-0農桿菌及擬南芥轉化與陽性轉化子驗證

將重組載體pCAMBIA1205-GFPn-MsSDCS-0使用凍融法轉化至GV3101農桿菌。挑取農桿菌轉化克隆作為PCR模板，以35SF為正向引物，目的基因特有MsSDCS-0R為反向引物進行菌落PCR，擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2A所示。為考察目的基因在擬南芥中的表達模式，以農桿菌介導的方式將所構建的植物GFP熒光表達載體轉化至擬南芥中，T1代種子在含潮霉素的MS平板上進行篩選，并提取篩選平板上的陽性植株基因組DNA為模板，以與鑒定陽性農桿菌相同的引物進行PCR擴增，擴增結果如圖2B所示。

圖2 pCAMBIA1205-GFPn-MsSDCS-0轉化、GV3101菌落及擬南芥PCR驗證

圖2A顯示不同的轉化農桿菌均可擴增出一條大約1600 bp的陽性條帶，片段大小約為1000bp，2x35S長度約為600 bp，擴增條帶大小與理論預期大小相符，此結果表明植物熒光GFP表達載體轉化農桿菌成功，可以用于擬南芥植物的轉化過程。

從圖2B中可看出，在所選取的11株擬南芥轉化株中，4株可擴增出一條處于約1.6 Kb陽性帶，而未轉化植株無陽性特征條帶。擴增出的陽性條帶明顯，片段大小與農桿菌中的陽性條帶相同，考慮其所用引物的特異性，可確認目的基因植物GFP熒光表達載體已成功轉化至擬南芥中。

2.3 MsSDCS-0的亞細胞定位觀察

為考察目的基因在細胞中的亞細胞定位，將所構建的重組植物GFP熒光表達載體以PEG方法轉化至擬南芥野生型（Col-0）原生質體中，表達24 h后在Confocal上進行熒光觀察，原生質體中GFP熒光觀察如圖3所示：

圖3 pCAMBIA1205-GFPn-MsSDCS-0轉化擬南芥后MsSDCS-0蛋白的熒光亞細胞定位

圖3基因熒光圖譜顯示：在所觀察的細胞中，目的基因表達蛋白熒光信號主要出現(xiàn)于胞質中或細胞器中，表明目的基因在細胞中主要定位于胞質或細胞器中。

2.4 重組質粒載體pCAMBIA1205-GFPn-MsS?DCS-0轉基因擬南芥表型觀察

苜蓿半胱氨酸合成酶成員MsSDCS-0主要參與植物體內半胱氨酸的合成，為確認當該基因成員在植物體內過表達后是否會對植物的生長產生影響，本研究中獲得MsSDCS-0的擬南芥后，將其T1代種子種植于營養(yǎng)缽中，當生長至3-4周后觀察其生長表型是否會發(fā)生變化，典型的MsSDCS-0轉基因擬南芥生長表型如圖4所示：

圖4 MsSDCS-0轉擬南芥陽性植株表型觀察

圖4顯示，與野生型擬南芥相比，過表達MsS?DCS-0的擬南芥在3-4周的生長表型，包括葉的數(shù)目、形狀及葉色上并未顯示出差異。表明當MsS?DCS-0在植物體內過表達后不會對植物的正常生長產生有害的影響。

2.5 pCAMBIA1205-GFPn-MsSDCS-0在擬南芥根中的表達模式

基因表達模式預示著基因的功能，為考察Ms?SDCS-0在轉基因擬南芥中的在體表達模式，將目的基因的植物GFP熒光表達載體轉入擬南芥中，使用GFP熒光觀察轉擬南芥根尖目的基因表達模式，目的基因在轉基因擬南芥根尖的GFP熒光Confocal圖像如圖5所示：與在擬南芥中所觀察到的該基因亞細胞定位一樣，該基因在轉基因擬南芥根尖中的GFP熒光信號主要表達于植物細胞的胞質中，在部分細胞中也可在核中檢測到該基因的GFP熒光信號，從上述結果可看出，該基因在體也主要表達于細胞胞質中。

圖5 轉基因擬南芥根尖目的基因GFP圖像

3 討 論

本研究對含pBSC-MsSDCS-0克隆載體陽性菌株進行復蘇純化并提取質粒，將其與pCAM?BIA1205-GFPn載體使用Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切，純化后使用T4 DNA連接酶進行連接，最終構建成功GFP融合的目的基因植物表達載體。驗證載體正確后使用PEG方法轉化入野生型擬南芥（Col-0）原生質體中，熒光觀察目的基因的定位。同時將目的基因植物表達載體轉入農桿菌GV3101，對野生型擬南芥（Col-0）根尖進行熒光觀察，確認該基因的表達模式。此外，對轉基因擬南芥的生長表型進行了觀察。

本研究結果表明：MsSDCS-0擬南芥原生質體及在體植物根尖中主要定位于細胞質中，并在植物細胞器中也可檢測到熒光信號，表明部分該蛋白成員也存在于植物細胞器中。植物CSase家族存在多個同工酶成員，已有研究表明，不同植物其成員組成不同，水稻有9個同工酶，擬南芥有9個，高粱和大豆各6個，毛果楊有10個[7]。在擬南芥中對于Cys合成所需的同工酶和編碼基因已經有了比較詳細的研究，CSase家族中的9個成員的基因序列已全部測出。[8]通過生化分析已確認，擬南芥中合成半胱氨酸的主要同工酶有OAS-TL A1（細胞質）、OAS-TLB（葉綠體）、和OAS-TLC（線粒體）。其合成的主要場所是葉肉細胞胞質，酶活性可以達到細胞總OAS-TL活性的95%以上。[8-11]本研究結果表明苜蓿半胱氨酸合成酶MsSDCS-0成員主要定位于擬南芥胞質中，此與已有的成果相一致，說明其與擬南芥相應成員序列的高相似性與其功能的一致性。也說明該成員主要在胞質中參與植物半胱氨酸合成的功能。

然而，前期對該成員的體外活性測試顯示，該酶是一個雙功酶，體外活性測試中表現(xiàn)出了2種活性。其不僅具有半胱氨酸合成酶的活性，也表現(xiàn)出了氰基丙氨酸合成酶的活性，此活性的功能主要用于細胞內對CN-的解毒上，并主要在細胞器如線粒體中進行[12]。本研究中MsSDCS-0不僅定位于胞質中，也存在于細胞器中，猜測其在細胞不同的部位行使不同的功能。然而，該成員在細胞中定位于不同的部位，或其可進行跨膜轉輸，仍需對此機理做進一步的研究。

在擬南芥中過表達苜蓿半胱氨酸合成酶成員MsSDCS-0未發(fā)現(xiàn)植物生長表型異常，表明在提高植物體內Cys合成或其他含硫氨基酸含量時，沒有對植物的生長產生影響。猜測在植物體內可能存在其他的調節(jié)元件或機制，以對抗該基因的過表達影響，使其生長表型未發(fā)生變化。然而，植物細胞內任何的基因過表達均會對其整個代謝網(wǎng)絡發(fā)生擾動，此種影響可能是本研究未檢測的項目。因此，對轉基因植物中含硫氨基酸含量的測定及其他的生理指標的測定也是本研究的進一步工作。