懸鉤子屬植物的組培快繁技術(shù)研究進(jìn)展

楊鼎元，張群英*，陳 哲，李永霞

（貴州省植物園，貴州貴陽(yáng) 550004）

懸鉤子屬（Rubus L.）是薔薇科（Rosaceae）中的一個(gè)大屬[1]，在我國(guó)已記錄該屬植物有194種，88變種，被分為8個(gè)組，24個(gè)亞組[2]。本屬植物大多果實(shí)多漿，味甜酸，可供食用，在歐美已作為重要水果[3]長(zhǎng)期栽培；有些種類的果實(shí)、種子、根及葉可入藥；莖皮、根皮可提制栲膠[4]；少數(shù)種類庭園栽培供觀賞[5-6]。

我國(guó)懸鉤子資源較為豐富，不斷有新種被發(fā)現(xiàn)[7-10]，農(nóng)藝性狀優(yōu)良的懸鉤子屬植物一旦馴化種植成功，往往當(dāng)年掛果，生長(zhǎng)期可達(dá)數(shù)十年，可以使種植者獲得穩(wěn)定的經(jīng)濟(jì)來(lái)源。近年來(lái)[11]，國(guó)外懸鉤子屬的紅樹莓（Rubus idaeus L.）品種秋來(lái)斯（Autumn Bliss）、那好（Navaho），黑樹莓（Rubus mesogaeus） 品種薩利（Shawnee）等作為“第三代水果”被大量引入我國(guó)，產(chǎn)生了較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效應(yīng)。但與國(guó)外對(duì)比，我國(guó)的懸鉤子屬植物資源，未能充分開發(fā)利用；同時(shí)國(guó)外引進(jìn)的懸鉤子屬植物品種極易造成品種老化，退化嚴(yán)重[12]。因此，建立一套高效的快速繁殖體系，不但有利于新品種的開發(fā)，更是擴(kuò)大本土優(yōu)良品種繁殖的重要手段，也可短時(shí)間內(nèi)獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)組培苗以滿足種植商需求。

對(duì)懸鉤子屬植物的組織培養(yǎng)技術(shù)方面的研究進(jìn)行了總結(jié)和展望，并探討了懸鉤子屬植物比較有價(jià)值的研究方向，旨在為將來(lái)快速繁育適合市場(chǎng)的優(yōu)良懸鉤子屬品種及其優(yōu)質(zhì)栽培提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 懸鉤子屬植物的組培快繁技術(shù)綜述

1.1 外植體選擇

植物組織培養(yǎng)常用的材料是植物的組織和器官，但也有使用植物細(xì)胞作為初始材料的。外植體的污染和褐化是懸鉤子屬植物進(jìn)行初代培養(yǎng)時(shí)必須解決的問(wèn)題，選擇適宜的外植體，不但可以降低污染和褐化率，也可提高成活率，為之后的繼代增殖提供較多的材料。

在懸鉤子屬植物的組培實(shí)驗(yàn)中，通常選取的外植體材料是一年生帶芽嫩莖（單芽莖段）[13,14]、莖尖[15]或以未萌發(fā)的腋芽作為材料[16-18,20]，王禹[19]認(rèn)為帶腋芽的嫩枝莖段外層包裹的芽鱗片易于剝離，可以減少污染，而且在田間易于取材，王岳英[20]的研究支持這種方法。但也有研究者[14,21]認(rèn)為從莖段上剝下芽并去除芽鱗片來(lái)作為接種外植體的方法對(duì)比直接滅菌接種的方法更能提高萌發(fā)率，降低污染率。究其原因，幼嫩芽體直接接觸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，芽體生長(zhǎng)點(diǎn)較容易吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而促其萌發(fā)；而單芽莖段，接種中以莖梗接觸培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需經(jīng)莖梗運(yùn)輸?shù)窖矿w，經(jīng)切割和消毒后，莖梗運(yùn)輸系統(tǒng)勢(shì)必在一定程度上受損，故芽體生長(zhǎng)點(diǎn)較難吸收到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且受消毒后變褐的鱗片束縛，故其萌發(fā)率較低[28]。

許多研究者[14-20]發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)選取的同種懸鉤子屬植物材料的外植體在初代培養(yǎng)中以相同處理后接種的萌發(fā)率、污染率、褐變率各不相同，其研究結(jié)果均表明在每年4～5月進(jìn)行的外植體初代培養(yǎng)往往具有較高萌發(fā)率，更低的污染率、褐化率，這可能是因?yàn)?、5月份懸鉤子屬植物處于生長(zhǎng)旺盛期，體內(nèi)激素水平較高[13]，因此萌芽率較高；6～8月份進(jìn)入雨季容易造成枝條更高的污染率；9～11月份枝條木質(zhì)化嚴(yán)重，導(dǎo)致褐化嚴(yán)重；當(dāng)年12月～次年3月植株處于休眠狀態(tài)，故萌發(fā)率較低[13,14,17,20]。

1.2 外植體消毒

挑選合適的懸鉤子屬植物外植體后，在接種前須經(jīng)嚴(yán)格滅菌，一般步驟如下：材料除去不需要的部分，用流水沖洗→細(xì)毛刷清洗→飽和肥皂水[13]或洗潔精[14]清洗→自來(lái)水清洗→轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)75%酒精浸泡30S→消毒劑消毒→無(wú)菌水沖洗5遍→接種。

在懸鉤子屬植物組培中，常見(jiàn)的消毒劑有以下3種：①75%酒精：此濃度下的酒精具備較強(qiáng)滅菌效果，有利于其他消毒劑滲入，但對(duì)植物組織損傷較大故消毒時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，因而不能徹底滅菌，須配合其他殺菌劑使用。②氯化汞（HgCl2）：又稱升汞，有劇毒，常用0.1%濃度處理5～15min，滅菌效果較強(qiáng)，但殘毒較大須無(wú)菌水多次沖洗，酒精加升汞的滅菌方式是懸鉤子屬植物組培中采用的最多的體外消毒方式。③次氯酸鈉：通常采用2%～10%濃度滅菌，處理時(shí)間15～30min，滅菌效果較好，易于去除，且對(duì)植物無(wú)害，須配合酒精使用加強(qiáng)滅菌效果。

懸鉤子屬植物表面特別是莖大多披絨毛、細(xì)刺較容易在之后環(huán)節(jié)中因表面消毒不夠徹底產(chǎn)生污染，郭玉霞[16]等在超凈工作臺(tái)內(nèi)以滅過(guò)菌的手術(shù)刀片將絨毛細(xì)刺刮去的方法降低污染率，有研究者[20]針對(duì)這類材料采用在滅菌劑中添加數(shù)滴0.1%濃度的Tween20的方法提高外植體滅菌效果。

1.3 培養(yǎng)基和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

對(duì)于懸鉤子屬植物，常見(jiàn)的 MS、MT、White、N6、B5、NT等培養(yǎng)基均能滿足懸鉤子屬植物生長(zhǎng)需要[23]，但國(guó)內(nèi)外的研究者們更多地選擇MS培養(yǎng)基，主要是因?yàn)闊o(wú)機(jī)鹽和離子濃度較高，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，能滿足植物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和生理需要，同時(shí)Poothong[24]等人發(fā)現(xiàn)合理增大培養(yǎng)懸鉤子屬植物CaCl2、MgSO4和KH2PO4等無(wú)機(jī)鹽含量能顯著促進(jìn)其生長(zhǎng)，因此，可以認(rèn)為MS培養(yǎng)基是非常適合懸鉤子屬植物組培的培養(yǎng)基種類。

在懸鉤子屬植物組織培養(yǎng)中主要采用6-BA（芐氨基腺嘌呤）、NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、6KT（N6-呋喃甲基腺嘌呤）、GA3（赤霉素）、IBA（吲哚丁酸）、C2H4（乙烯）等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，但劑量在不同種類的接種材料、組培過(guò)程中的不同階段而各不相同，如表1-3所示。

表1 在懸鉤子屬植物的啟動(dòng)培養(yǎng)中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比

表2 在懸鉤子屬植物的增殖培養(yǎng)中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比

表3 在懸鉤子屬植物的生根培養(yǎng)中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比

在懸鉤子屬植物的啟動(dòng)培養(yǎng)中均使用MS培養(yǎng)基，由表1可知，使用最多的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是6-BA、NAA和GA3這3種調(diào)節(jié)劑，其中所有的懸鉤子屬植物的啟動(dòng)培養(yǎng)都使用了6-BA，其劑量范圍從0.2～1.0mg/L，在相應(yīng)報(bào)道中，均取得較高的接種萌發(fā)率。

在懸鉤子屬植物的增殖培養(yǎng)中均使用MS培養(yǎng)基，由表2可知，使用最多的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是6-BA和NAA這2種調(diào)節(jié)劑，懸鉤子屬植物的增殖培養(yǎng)都使用了這2種調(diào)節(jié)劑，其劑量范圍從0.5～1.0mg/L（6-BA）、0.05～0.2mg/L（NAA），6-BA與NAA的劑量比例保持在1（6-BA）∶0.1（NAA），有研究者[29]采用響應(yīng)面法優(yōu)化紅樹莓組培苗增殖培養(yǎng)條件，其結(jié)果表明6-BA濃度在1.59mg/L時(shí)，增殖系數(shù)最高。

由表3可知，在懸鉤子屬植物的生根培養(yǎng)中均使用1/2MS培養(yǎng)基，使用最多的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是NAA和IBA這 2種調(diào)節(jié)劑，其劑量范圍從0.05～1.0mg/L（NAA）、0.05～1.0mg/L（IBA），一方面采用1/2MS培養(yǎng)基，減少營(yíng)養(yǎng)成分，加強(qiáng)懸鉤子屬植物的自養(yǎng)；另一方面添加了利于根系生長(zhǎng)的NAA、IBA等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑促進(jìn)生根，其中郭玉霞[15]等人在生根培養(yǎng)基底部中加入活性炭吸附營(yíng)養(yǎng)成分，進(jìn)而促進(jìn)生根的方法被證實(shí)相同狀況下，生根培養(yǎng)基中添加少量活性炭能顯著地促進(jìn)懸鉤子屬植物生根。

1.4 煉苗移栽

當(dāng)懸鉤子屬組培苗生根后，就需要對(duì)瓶?jī)?nèi)苗進(jìn)行移栽前煉苗處理，因?yàn)榇筇锃h(huán)境、溫室條件與組織培養(yǎng)的環(huán)境有很大的不同，比如光照強(qiáng)度、溫度、空氣濕度以及環(huán)境無(wú)菌到非無(wú)菌等差別。

1.4.1 介質(zhì)選擇及消毒。種植介質(zhì)通常選用疏松透氣、保水性佳易消毒滅菌的泥炭土、珍珠巖、蛭石、粗沙等。介質(zhì)使用前需消毒，可用高壓、曝曬、消毒劑等方法[22]。

1.4.2 煉苗。應(yīng)分階段進(jìn)行，即松開組培瓶蓋1～2天→開蓋1～2天→完全打開蓋子，最后將小苗根部培養(yǎng)基小心沖洗干凈后再轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)滅菌介質(zhì)中。同時(shí)應(yīng)注意瓶?jī)?nèi)苗因在容器內(nèi)時(shí)濕度較高，轉(zhuǎn)移最初幾天應(yīng)保持小苗周圍空氣濕度在90%～100%的范圍內(nèi)為佳，提高小苗成活率[18]。

1.4.3 注意環(huán)境條件。小苗移栽后因?yàn)橛僧愷B(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)，應(yīng)適當(dāng)加強(qiáng)光照強(qiáng)度[18,29]，約在1500～3000Lx之間，如有條件，應(yīng)使整個(gè)煉苗過(guò)程的溫度保持在20～25℃。

2 展望

我國(guó)懸鉤子屬植物資源十分豐富，近年來(lái)陸續(xù)有研究者不斷從中開發(fā)出新的天然產(chǎn)物、膳食資源、藥用活性成分[30]，如陳雪香[31]通過(guò)對(duì)懸鉤子屬植物山梅葉片內(nèi)葉萜類和酚類物質(zhì)分離、結(jié)構(gòu)鑒定等以及抗腫瘤研究，發(fā)現(xiàn)山梅對(duì)于差異蛋白主要作用結(jié)直腸癌通路、氧化磷酸化通路、細(xì)胞周期、p53通路和Wnt等通路,在這些通路中對(duì)抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。李程[32]等通過(guò)對(duì)樹莓組培苗未生根和生根2個(gè)時(shí)期的組培苗為材料，對(duì)其各個(gè)部位的抗氧化酶活性、總酚含量及其對(duì)DPPH自由基的清除作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)樹莓苗具有較強(qiáng)的對(duì)DPPH自由基的清除能力，對(duì)于將樹莓作為藥食領(lǐng)域的開發(fā)與利用提供了理論依據(jù)。

雖然懸鉤子屬植物的繁殖方法簡(jiǎn)單，但目前國(guó)內(nèi)栽培的懸鉤子屬植物品種多由國(guó)外引進(jìn),其品種來(lái)源往往不確定,故極易造成品種老化，退化嚴(yán)重[12]。因此建立一套高效的快速繁殖體系，不但有利于純化國(guó)外引種品種也是擴(kuò)大本土優(yōu)良品種繁育時(shí)的重要手段，同時(shí)國(guó)外研究者[23]已經(jīng)利用組培手段成功從受感染的懸鉤子屬植物中去除蘋果花葉病毒和樹莓叢狀矮病毒，進(jìn)一步展現(xiàn)了組織培養(yǎng)技術(shù)在優(yōu)化植物性狀方面的潛能。因此懸鉤子屬植物不但在產(chǎn)品開發(fā)上有極大研究潛力，在組培方面的研究同樣具備極大的空間。