結直腸癌術后患者化療前后外周血NKT及NK細胞表達分析

史鐘　郁肖夫　朱靜　袁梅琴　呂汪霞　馮婷婷　鐘海均

[摘要] 目的 觀察結直腸癌術后患者化療前后外周血淋巴細胞亞群的變化，評估患者免疫功能狀態(tài)變化。 方法 納入浙江省腫瘤醫(yī)院2016年1～12月住院的結直腸癌根治術后Ⅱ～Ⅲ期患者74例，健康對照組為25例同期我院就診的非惡性腫瘤患者，采用流式細胞術分析輔助化療第1、6、8周期前1 d外周血淋巴細胞亞群比例。 結果 結直腸癌根治術后患者外周血中CD3+（P=0.1532）、CD3+CD4+（P=0.1107）、CD3+CD8+（P=0.2576）T細胞與健康對照組比較無差異（P>0.05），而CD3+CD56+ NKT細胞（P=0.0210）及CD3-CD56+ NK細胞（P=0.0045）較健康對照者顯著升高（P<0.05）。術后輔助化療6周期前NK、NKT細胞比例均無顯著變化，P>0.05。8周期前NKT細胞比例無顯著變化（P>0.05），NK細胞比例僅輕度下降（19.10±4.63 vs 20.31±4.66，P=0.046）。 結論 結直腸癌根治術后患者NK及NKT細胞比例較健康人顯著升高，且輔助化療后表達率保持穩(wěn)定。

[關鍵詞] 結直腸癌;淋巴細胞亞群;NK細胞;NKT細胞

[中圖分類號] R730.4? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）10-0086-04

Expression of peripheral blood NKT and NK cells in postoperative colorectal cancer patients before and after chemotherapy

SHI Zhong YU Xiaofu ZHU Jing YUAN Meiqin LV Wangxia FENG Tingting ZHONG Haijun

Department of Abdominal Oncology， Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou? ?310022， China

[Abstract] Objective To observe the changes of peripheral blood lymphocyte subsets in patients with postoperative colorectal cancer before and after chemotherapy， and to evaluate the changes of immune function status. Methods 74 patients with stage Ⅱ-Ⅲ colorectal cancer after radical resection admitted in Zhejiang Cancer Hospital from January to December 2016 were enrolled. 25 non-malignant patients in the same period in our hospital were selected as the control group. Flow cytometry was used to analyze the proportion of peripheral blood lymphocyte subsets at one day before the first， sixth and eighth cycles of adjuvant chemotherapy. Results There were no differences in CD3+（P=0.1532）， CD3+CD4+ （P=0.1107）， CD3+CD8+ （P=0.2576） T cells in the peripheral blood between patients with colorectal cancer after radical operation and control group（P>0.05）. While CD3+CD56+ NKT cells （P=0.0210） and CD3-CD56+ NK cells （P=0.0045） in the patients with colorectal cancer after radical operation were significantly higher than those of the control group （P<0.05）. There was no significant change in the proportion of NK and NKT cells before 6 cycles of postoperative adjuvant chemotherapy（P>0.05）. There was no significant change in the proportion of NKT cells before 8 cycles （P>0.05）， and the proportion of NK cells only decreased slightly（19.10±4.63 vs 20.31±4.66，P=0.046）. Conclusion The proportion of NK and NKT cells in patients with colorectal cancer after radical resection was significantly higher than that in healthy people， and the expression rate remains stable after adjuvant chemotherapy.

[Key words] Colorectal cancer; Lymphocyte subsets; NK cells; NKT cells

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是歐美國家最常見的惡性腫瘤之一，在中國，隨著經濟發(fā)展及飲食結構的變化，發(fā)病率亦逐年遞增，2015年發(fā)病率和死亡率均位于所有惡性腫瘤的第5位，嚴重危害居民的健康[1]。手術仍是早中期結直腸癌的主要治療手段，而術后輔助化療目前是高復發(fā)風險（Ⅲ期及部分Ⅱ期）結直腸癌的標準治療。近年來，越來越多的研究發(fā)現免疫細胞在惡性腫瘤發(fā)展的不同階段（起始到轉移擴散到生長）中起到了控制腫瘤的作用[2]。而手術及放化療對免疫系統的“破壞”，是一部分患者抗拒手術及化療的主要顧慮。目前認為，參與抗腫瘤的細胞免疫的效應細胞主要有T細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞、自然殺傷T（natural killer T，NKT）細胞等，CD3+ T細胞主要參與特異性免疫，而NK、NKT細胞參與固有免疫（非特異性免疫）。外周血淋巴細胞亞群分析能從一定程度上反應機體的免疫狀態(tài)。為評估結直腸癌患者術后及輔助化療后抗腫瘤免疫反應狀態(tài)，本研究對74例結直腸癌患者外周血淋巴細胞亞群的動態(tài)變化作了觀察，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集浙江省腫瘤醫(yī)院2016年1～12月于大腸外科住院手術，并之后于腹部腫瘤內科行輔助化療的結直腸癌患者。納入標準：（1）所有患者均經手術病理確診為結腸癌或直腸癌（其中直腸癌患者為高位直腸癌，手術前后未行放療）;（2）病理分期為Ⅱ～Ⅲ期，影像學檢查未發(fā)現其他遠處轉移;（3）既往無其他惡性腫瘤手術、化療或放療史;（4）年齡18～75歲，ECOG評分0～1分;（5）無其他嚴重并發(fā)癥和化療禁忌證;（6）排除合并肺結核、肝炎和艾滋病等傳染性疾病以及免疫系統相關疾病的患者。

根據納入標準選取患者共74例，其中男38例，女36例。年齡26～71歲，中位年齡55歲。右半結腸癌28例，左半結直腸癌46例。免疫組化錯配修復蛋白（mismatch repair，MMR）檢測為錯配修復缺陷（mismatch repair deficient，dMMR）6例，錯配修復完全（mismatch repair proficient，pMMR）63例，未檢測5例。其中根據2017年UICC-AJCC臨床分期第8版分為ⅡB期20例，ⅡC期1例，ⅢA期5例，ⅢB期31例，ⅢC期17例。病理類型：均為腺癌，其中黏液腺癌7例。分化程度：高-中分化1例，中分化57例，中-低分化12例，低分化4例。74例患者術后均無化療禁忌。

所有患者均術后3～4周內給予輔助化療，其中XELOX方案化療69例，卡培他濱口服化療2例，mFolfox6方案化療3例。

健康對照組為25例同期我院就診的非惡性腫瘤患者，且未合并肺結核、肝炎和艾滋病等傳染性疾病以及免疫系統相關疾病。其中男12例，女13例。年齡23～70歲，中位年齡52歲。健康對照組與腸癌組患者的年齡、性別具有可比性（P>0.05）。

1.2 標本采集及檢測

所有患者于術后第1次化療前、第6、8次化療前1 d抽取空腹靜脈血5 mL，檢測外周靜脈血中相關淋巴細胞亞群的比例。

1.2.1 試劑及儀器? CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5四聯標記單克隆抗體﹑CD45-FITC/CD56-RD1/CD19-ECD/CD3-PC5四聯標記單克隆抗體﹑OptiLyse C溶血素﹑Immuno-Trol全血質控品及儀器光路流路校正品Flowcheck。采用FC500流式細胞儀（flow cytometry method，FCM）分析。以上試劑及儀器均來自美國Beckman Coulter公司。

1.2.2 流式細胞檢測及分析? 采用肝素鈉抗凝全血進行熒光標記，100 μL全血分別與10 μL CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5四聯標記單克隆抗體或CD45-FITC/CD56-RD1/CD19-ECD/CD3-PC5四聯標記單克隆抗體，室溫避光孵育15 min，OptiLyse C溶血素溶血后避光孵育15 min，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌一次，最后用500 μL PBS重懸細胞待FCM分析。每次檢測均用Immuno-Trol進行全程質控。所有測定隨常規(guī)樣本分析進行。采用CXP Analysis分析系統，根據檢測需要設計方案中所需的散點圖﹑直方圖。采用同型對照抗體確定線性門的位置和檢測方案電壓;在電壓確定的基礎上進行顏色補償：去掉兩種熒光的發(fā)射光譜中重疊部分，確保所檢測熒光表達的準確性。針對前向散射（forward scatter，FS）與側向散射（side scatter，SS）細胞分群所得淋巴細胞進行分析，在相應的直方圖的散點圖中讀取相應CD分子的陽性表達率。每次分析前用Flowcheck進行儀器光路和流路的校正，保證FS和各熒光通路的半高峰變異均<2%;并采用Immuno-Trol質控品進樣本檢測的質量控制。

1.3 統計學方法

統計由SPSS 15.0及Microsoft Office Excel 2007軟件完成。計量資料以（x±s）表示，成組資料兩樣本均數比較用雙尾t檢驗，化療前后指標比較采用雙尾配對t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌術后患者與健康人外周血淋巴細胞亞群表達率比較

腸癌根治術后患者外周血中CD3+（總T細胞）（P=0.1532）、CD3+CD4+（輔助/效應T細胞）（P=0.1107）、CD3+CD8+（抑制/細胞毒T細胞）（P=0.2576）T細胞與健康對照組比較無差異（見表1）。而CD3+CD56+ NKT細胞（P=0.0280）及CD3-CD56+ NK細胞（P=0.0039）較健康對照者顯著升高。見表1。

2.2 結直腸癌患者術后輔助化療前后外周血NKT細胞及NK細胞表達率分析

剔除了15例未完成全部輔助化療的患者（12例為XELOX方案，3例為mFolfox6方案），余59例患者均完成了7～8周期的XELOX方案或卡培他濱方案化療，對這59例患者進行分析（其中6例患者第8周期化療前1 d驗血發(fā)現血小板Ⅲ°減少等化療禁忌，未行第8周期化療）?？紤]6個月（一般為8周期XELOX方案或卡培他濱方案）的輔助化療（Ⅲ期T1-3N1低?；颊呖?個月）為腸癌術后標準治療，本文主要研究標準治療后的患者免疫狀態(tài);并結合文獻中的方法及數據結果[3]，我們對患者第6、8周期化療前1 d的外周血進行分析（mFolfox6方案患者擬分析8、12周期前1 d，但患者均未完成治療）。腸癌患者術后輔助化療6周期前NK、NKT細胞比例均無顯著變化（P>0.05）（表2）。8周期前NKT細胞比例無顯著變化（P>0.05），NK細胞比例僅輕度下降（19.10±4.63 vs. 20.31±4.66，P=0.0431）。見表2。

3 討論

腫瘤細胞對宿主的適應是腫瘤進展、治療失敗以及機體最終死亡的一個重要原因。轉化的細胞不斷的面臨免疫選擇，能在免疫攻擊下存活的細胞被保留，而不能逃避免疫攻擊的則被清除[4，5]。參與抗腫瘤的細胞免疫的效應細胞主要有T細胞、NK細胞、NKT細胞等，CD3+T細胞主要參與特異性免疫，而NK及NKT細胞均為體內抗腫瘤固有免疫反應的重要細胞。本研究發(fā)現在結腸癌根治術后患者的外周血中，CD3+（總T細胞）、CD3+CD4+（輔助/效應T細胞）、CD3+CD8+（抑制/細胞毒T細胞）T細胞比例與健康人無顯著性差異;而CD3+CD56+ NKT細胞及CD3-CD56+ NK細胞比例均較健康人顯著升高，且保持穩(wěn)定不受輔助化療影響，提示我們固有免疫可能在這類患者中發(fā)揮更重要的作用。

固有樣T細胞是一類非肽類識別的T細胞，是哺乳動物T細胞的一個重要組成部分。最近的一些研究表明這些固有樣T細胞在調節(jié)腫瘤免疫反應中發(fā)揮重要作用，因而潛在可用于腫瘤免疫治療的開發(fā)。而腫瘤免疫中最具代表性的固有樣T細胞亞群為NKT細胞[6，7]。一方面，NKT 細胞可通過 Fas/FasL 途徑、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α途徑以及穿孔素途徑發(fā)揮直接抗腫瘤作用[8]，且多項研究報道了NKT細胞在體外能有效殺傷白血病、肺癌、胰腺癌、宮頸癌、惡性黑色素瘤等多種血液或實體腫瘤細胞株[9]。另一方面，根據是否對α-半乳糖神經酰胺（α-galactosylceramide，α-GalCer）/CD1d 復合體發(fā)生反應，NKT 細胞被分為經典NKT細胞（invariant NKT， iNKT或Ⅰ型 NKT）和非經典NKT細胞（variant NKT， vNKT或Ⅱ型 NKT）[10]。iNKT細胞被激活后主要分泌干擾素（interferon，IFN）-γ、白介素（interleukin，IL）-2等T輔助細胞（T helper cells，Th）1類細胞因子，在腫瘤免疫中主要起到抗腫瘤作用;vNKT細胞激活后主要分泌如IL-13、IL-4等Th2類細胞因子，在腫瘤免疫中主要發(fā)揮抑制作用，形成雙向免疫調節(jié)模式[11，12]。綜上所述，NKT細胞既是一種重要的固有免疫效應性細胞，也作為免疫調節(jié)細胞參與適應性免疫應答。本研究發(fā)現腸癌術后患者外周血NKT細胞比例顯著高于健康人，提示腸癌患者中NKT細胞介導的腫瘤免疫反應處于活化狀態(tài)?？紤]到NKT細胞在抗腫瘤免疫反應中的作用為雙向調節(jié)，且多個研究發(fā)現腫瘤患者的iNKT細胞數目減少且功能缺失[13]，因此，這種活化是否有利還難以下定論。如進一步分析這些患者外周血中NKT的分型，將能更明確闡述其腫瘤免疫反應狀態(tài)。

NK細胞是固有免疫的主要效應細胞之一，其不需要主要組織相容性復合體的抗原提呈，就可識別和殺死腫瘤細胞[14]。一方面，NK細胞可以通過分泌穿孔素（Perforin）和顆粒酶B（Granzyme B）等直接裂解并殺傷腫瘤細胞;另一方面，還可以通過分泌IFN-γ等細胞因子，參與免疫調控而促進抗腫瘤免疫反應[15]。有研究發(fā)現轉移性結直腸癌患者中NK細胞活性強的患者治療緩解率更高，無進展生存期（progression free survival，PFS）更長[16]。本研究發(fā)現腸癌術后患者外周血NK細胞比例顯著高于健康人，但未發(fā)現NK細胞比例與腫瘤患者臨床及分子病理特征之間的關系，有待更全面的研究及生存隨訪數據來全面闡述NK細胞比例升高的意義。

本文研究還存在如下一些局限性。已有研究表明，dMMR腸癌患者腫瘤組織有更多的免疫細胞浸潤[17，18]，左右半結腸的分子生物學特征及免疫狀態(tài)也有很大差異，但本研究從MSI狀態(tài)與腫瘤部位兩個角度進行分層分析（數據未列出），均未發(fā)現有差異，可能與樣本量不足有關。本研究選取的對象為腸癌根治術后患者，與腫瘤負荷大的術前或者晚期患者相比可能免疫反應狀態(tài)有差異，化療對免疫狀態(tài)的影響也有差異[19]。另外，已有些個案報道發(fā)現高NK細胞比例的晚期腸癌患者治療后獲得臨床完全緩解以及長期生存[20]，而研究對象中也有數例患者NK或者NKT比例明顯高于正常標準。由于時間所限，研究中的患者目前還未能獲得復發(fā)生存相關的隨訪數據，如對這部分患者進行跟蹤隨訪，可能為NK或NKT細胞高表達與預后的關系提供更重要的臨床證據。

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