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    擬南芥CBL9的質(zhì)膜定位對(duì)花粉管頂端生長(zhǎng)的影響

    2019-06-04 07:04:46周利明房瑋
    生物技術(shù)通報(bào) 2019年5期
    關(guān)鍵詞:花粉管質(zhì)膜極性

    周利明 房瑋

    (華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,唐山 063210)

    開花植物的有性繁殖需要雄性配子體營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞特定區(qū)域的極性生長(zhǎng),從而逐漸形成花粉管。通過花粉管頂端的極性擴(kuò)展,花粉管向胚珠輸送精子并完成雙受精[1]。由于花粉管具備典型極性生長(zhǎng)的特性,且體外方便培養(yǎng),目前已被廣泛作為研究植物細(xì)胞極性發(fā)育的理想模式系統(tǒng)[2]。發(fā)掘極性生長(zhǎng)相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因子,闡述細(xì)胞極性建成與極性生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)理,是植物有性生殖方面的熱點(diǎn)領(lǐng)域,同時(shí)也為提高授粉效率這一增收策略提供一定的理論依據(jù)。

    花粉管的生長(zhǎng)過程是被嚴(yán)格調(diào)控的,并且依賴大量的信號(hào)組件,而鈣離子在其中起到極其重要的作用[3-5]。鈣離子在花粉管的伸長(zhǎng)過程中形成一定的濃度梯度,花粉管的頂端鈣離子濃度最高,而從頂端到底部濃度逐步遞減[6]。已有研究成果發(fā)現(xiàn)打破頂端鈣離子梯度會(huì)嚴(yán)重影響花粉管的正常生長(zhǎng),而鈣離子梯度偏轉(zhuǎn)會(huì)引起生長(zhǎng)軸的重新調(diào)整[7-8]。在許多物種中,頂端富集的鈣離子梯度可以表現(xiàn)出周期振蕩的特征,這種振蕩與花粉管增長(zhǎng)率的周期變化相關(guān)[5]。鈣離子泵(ACA9)、環(huán)核苷酸門控通道(CNGC18)及類谷氨酸受體(GLR1.2和GLR 3.7)的功能研究顯示它們?cè)谡{(diào)控花粉管增長(zhǎng)率、花粉管形態(tài)和與雌配子體的互作等方面都具有重要作用[9-11]。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了鈣信號(hào)的形成及維持對(duì)花粉管極性生長(zhǎng)的重要性。另一個(gè)重要的調(diào)控因子就是小G蛋白R(shí)OP1,其下游存在2個(gè)作用相反的效應(yīng)蛋白R(shí)IC3和RIC4,前者引起微絲的解聚,而后者促進(jìn)微絲的聚合。微絲動(dòng)態(tài)(解聚與聚合)的正常維持才能造就花粉管的頂端生長(zhǎng),這一過程受到ROP1活性的嚴(yán)格調(diào)控[12]。

    植物中鈣離子信號(hào)的傳遞是由一系列的鈣傳感器所介導(dǎo)的,鈣傳感器在與鈣離子結(jié)合后,發(fā)生構(gòu)象變化并將信息傳遞給下游目標(biāo),類鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B亞基(Calcineurin B-like protein,CBL)就是一類典型的鈣離子傳感器家族,擬南芥基因組編碼10個(gè)CBL成員,其下游效應(yīng)子是一組絲氨酸/蘇氨酸激酶,被命名為CBL互作蛋白激酶(CBL interacting protein kinase,CIPK)[13]。 不同的 CBL-CIPK復(fù)合體建立了復(fù)雜的鈣信號(hào)網(wǎng)絡(luò),可以從胞內(nèi)和胞外鈣庫(kù)的不同部位感知鈣信號(hào)[14-15]。CBL參與調(diào)節(jié)包括離子平衡和脅迫應(yīng)對(duì)等過程在內(nèi)的多種細(xì)胞過程。CBL1或CBL9協(xié)同CIPK23激活K+通道AKT1,從而使植物在低K+條件下正常生長(zhǎng)[16]。此外,鈣傳感器CBL4/SOS3與CIPK24/SOS2的復(fù)合體調(diào)節(jié)Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SOS1的活性,從而顯著提高植物的耐鹽性[17]。

    以往的CBL相關(guān)研究主要集中于植物對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)機(jī)制領(lǐng)域,較少涉及花粉管的極性生長(zhǎng)領(lǐng)域。本研究利用基因槍瞬時(shí)表達(dá)體系,分析了CBL9及其N末端保守位點(diǎn)的點(diǎn)突變體CBL9G2A的亞細(xì)胞定位與過量表達(dá)表型情況,旨在揭示CBL9在花粉管極性生長(zhǎng)中的功能及其調(diào)控機(jī)制,為提高授粉效率這一增收策略提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    煙草(Nicotiana tabacum)培養(yǎng)于溫室內(nèi),28℃恒溫,光周期為12 h/12 h?;驑屴D(zhuǎn)化前,收集新鮮的煙草花粉(每次轉(zhuǎn)化需8朵花的花粉)。擬南芥(Arabidopsis thalianaL.,col-0)生長(zhǎng)條件為 22℃、光周期16 h/8 h?;驑寣S媒鸱邸~網(wǎng)、微載體、易裂膜等購(gòu)自Bio-Rad公司(Bio-Rad,U.S.A.)。限制性內(nèi)切酶、Pyrobest DNA Polymerase、dNTP及T4 DNA ligase購(gòu)自六合通經(jīng)貿(mào)有限公司(代理Takara的產(chǎn)品)。凝膠回收試劑盒以及Taq DNA Polymerase購(gòu)自天根生化科技公司。Plasmid Mini Kits試劑盒的品牌為QIAGEN。T4 DNA ligase及AMV Reverse Transcriptase購(gòu)自Promega公司。

    1.2 方法

    1.2.1 基因克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 選取6周齡的擬南芥花朵提取總RNA,通過反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增獲得CBL9全長(zhǎng)序列。基于overlap-PCR技術(shù),將CBL9的N末端中第二位甘氨酸(Gly)定點(diǎn)突變?yōu)楸彼幔ˋla),獲得CBL9G2A點(diǎn)突變體,序列檢測(cè)正確的目的片段分別構(gòu)建到瞬時(shí)表達(dá)載體pBLAT:YFP(目的片段連接到黃色熒光蛋白YFP的N末端)。

    1.2.2 基因槍轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 采用Plasmid Mini Kits(QIAGEN,Germany)提取用于基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA,0.8 μg質(zhì)粒包裹在0.5 mg金粉上,通過基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到煙草花粉中。各項(xiàng)射擊參數(shù)為:易裂膜與微彈載體之間距離為2cm;微彈載體飛行距離為10 mm;微彈飛行距離為7 cm;易裂膜破裂壓力為1 100 psi;真空度為27 mm Hg。轉(zhuǎn)化完成的花粉在28℃,避光培養(yǎng)3-4 h后,分別通過熒光顯微鏡及共焦掃描顯微鏡對(duì)各自過表達(dá)表型及亞細(xì)胞定位進(jìn)行觀察與測(cè)量。

    1.2.3 熒光顯微鏡分析花粉管表型 將轉(zhuǎn)化獲得的花粉管放在OLYMPUS熒光倒置顯微鏡(MODE BX51)下觀察,顯微鏡配備的CCD攝像機(jī)(MODE DP70,OLYMPUS)用于拍攝轉(zhuǎn)化成功的花粉管。3次獨(dú)立的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)所獲得的照片通過Zeiss LSM圖像瀏覽器(3.2版)進(jìn)行測(cè)量分析(80根左右花粉管的長(zhǎng)度及頂端最寬處的直徑)。

    1.2.4 共焦激光掃描顯微鏡觀察亞細(xì)胞定位 通過共焦激光掃描顯微鏡(Model LSM 510 META,Zeiss)進(jìn)行花粉管中CBL9-YFP或CBL9G2A-YFP的亞細(xì)胞定位分析,顯微鏡激發(fā)光波段為488 nm,接受光波段為505-530 nm,通過Zeiss LSM圖像瀏覽器(3.2版)進(jìn)行相應(yīng)的圖像分析。

    2 結(jié)果

    2.1 CBL9在成熟花粉中高量表達(dá)分析

    目前,擬南芥鈣傳感器主要有4個(gè)基因家族:鈣調(diào)素(CaM)、類鈣調(diào)素(CML)、類鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B亞基(CBL)以及鈣離子依賴蛋白激酶(CPK)。CBL家族包含10個(gè)成員?;诰W(wǎng)上公布的基因芯片數(shù)據(jù)(https://www.genevestigator.ethz.ch/),生成CBL全家族成員的表達(dá)熱圖(Expression heatmap),通過顏色的深淺反映不同的CBL在各組織細(xì)胞中的表達(dá)情況(圖1)。CBL1主要在葉(保衛(wèi)細(xì)胞及葉肉細(xì)胞)與根(根冠及中柱)組織中表達(dá),CBL2、CBL3、CBL8及CBL9在成熟花粉中相對(duì)表達(dá)較高,而在其他組織中表達(dá)較少,或者不表達(dá)。CBL4與CBL10分別主要在花柄離區(qū)和莖尖中表達(dá)。CBL5-CBL7依次主要在下胚軸、柱頭及根冠中表達(dá)。CBL9作為花粉高量表達(dá)的典型代表,被選為進(jìn)一步研究的對(duì)象。

    圖1 CBL家族成員在各組織中的表達(dá)熱圖

    2.2 花粉高量表達(dá)CBL9的亞細(xì)胞定位及過表達(dá)表型分析

    利用基因槍技術(shù)將CBL9在煙草花粉中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),經(jīng)過3-4 h的花粉培養(yǎng),在共焦掃描顯微鏡下,單獨(dú)表達(dá)YFP的花粉管熒光呈彌散分布。而YFP標(biāo)記的CBL9則在花粉管質(zhì)膜上有清晰的表達(dá)(圖2-A)。CBL9-YFP定位于胞內(nèi)隨著胞質(zhì)環(huán)流運(yùn)動(dòng)的顆粒狀細(xì)胞器上(圖2-A)。通過生物學(xué)統(tǒng)計(jì)分析,大約80根花粉管的長(zhǎng)度以及花粉管頂端的最寬處直徑被測(cè)量統(tǒng)計(jì)(圖2-B),與對(duì)照相比,過表達(dá)CBL9的花粉管長(zhǎng)度顯著縮短,且寬度顯著增加。

    圖2 CBL9在花粉管中的定位(A)與過表達(dá)表型統(tǒng)計(jì)(B)

    2.3 CBL9的質(zhì)膜定位

    CBL9的N末端存在一個(gè)保守的氨基酸位點(diǎn)(圖3-A),即第二位的甘氨酸位點(diǎn),此位點(diǎn)對(duì)于CBL1的花粉管質(zhì)膜定位至關(guān)重要[18]。CBL9與CBL1的序列相似度超過89%,為了驗(yàn)證該位點(diǎn)的作用同樣適用于CBL9,將CBL9的第二位甘氨酸(G)定點(diǎn)突變?yōu)楸彼幔ˋ),從而構(gòu)建CBL9的點(diǎn)突變體(CBL9G2A)。

    花粉管亞細(xì)胞定位的觀察結(jié)果(圖3-B)顯示,CBL9-YFP有明顯的質(zhì)膜定位,然而CBL9G2A-YFP呈現(xiàn)出與YFP對(duì)照相一致的胞質(zhì)彌散分布。

    表型量化結(jié)果(圖3-C-D)顯示,過量表達(dá)CBL9G2A并沒有顯著影響花粉管的極性生長(zhǎng),即花粉管的長(zhǎng)度及寬度與對(duì)照沒有顯著差異。表明CBL9在花粉管中的功能發(fā)揮與其質(zhì)膜定位密切相關(guān)。

    圖3 CBL9點(diǎn)突變體在花粉管中的定位與表型分析

    3 討論

    鈣離子是花粉管極性生長(zhǎng)中至關(guān)重要的調(diào)節(jié)因子[4,19]。然而,對(duì)于花粉管中鈣離子信號(hào)如何被感知和傳遞并觸發(fā)下游反應(yīng)的認(rèn)識(shí)卻十分有限,迄今為止,只有少數(shù)信號(hào)組分已確定影響花粉管的萌發(fā)或生長(zhǎng)。本研究通過基因槍技術(shù),在煙草花粉中瞬時(shí)過量表達(dá)CBL9會(huì)使花粉管的頂端生長(zhǎng)形態(tài)發(fā)生改變,即花粉管長(zhǎng)度縮短,頂端腫脹。這一結(jié)果與Mahs等[18]所得出的結(jié)論相一致,進(jìn)一步印證了CBL9在花粉管頂端生長(zhǎng)中發(fā)揮重要的作用。另外,亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示CBL9主要定位于花粉管的質(zhì)膜及顆粒狀細(xì)胞器,相似的定位同樣體現(xiàn)在CBL9的同源基因CBL1(氨基酸相似度為89%)上。在前人的研究中[18],CBL1可以和標(biāo)記囊泡的染料FM4-64共定位,由此推測(cè)CBL9所定位的顆粒狀細(xì)胞器也可能為胞內(nèi)囊泡系統(tǒng)?;ǚ酃艿馁|(zhì)膜是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)與物質(zhì)交換的屏障,胞外的鈣離子通過位于質(zhì)膜上的離子通道,內(nèi)流到花粉管中,從而參與形成花粉管頂端的鈣離子梯度。維持正常的頂端鈣離子梯度對(duì)于花粉管生長(zhǎng)的速率與導(dǎo)向至關(guān)重要[1]。目前,多個(gè)離子通道參與該調(diào)控過程,其中包括環(huán)核苷酸門控通道(Cyclic nucleotide gated channel,CNGC)及類谷氨酸受體(Glutamate receptor-like,GLR)等。質(zhì)膜定位的CNGC18過量表達(dá)導(dǎo)致花粉管的異常生長(zhǎng),并伴隨著胞內(nèi)鈣離子在頂端的過量聚集[10,20]。另外,GLR1.2和GLR3.7是一類配體門控的離子通道,促進(jìn)鈣離子通過質(zhì)膜流入胞內(nèi),在生成鈣信號(hào)和濃度梯度等方面發(fā)揮關(guān)鍵功能[9]。由此可以推測(cè)質(zhì)膜定位的CBL9可能通過作用于某一或某些離子通道,參與調(diào)控胞內(nèi)的鈣離子梯度的正常建立與維持。

    研究顯示CBL1的N末端存在肉豆蔻?;妥貦磅;揎椢稽c(diǎn),這兩類脂質(zhì)修飾一方面可以影響CBL1蛋白到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的途徑,另一方面也可以妨礙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)由囊泡體系到頂端質(zhì)膜的過程[21]。對(duì)CBL1的N末端保守位點(diǎn)進(jìn)行修改,能夠有效阻斷這兩種脂質(zhì)修飾,以此獲得CBL1的點(diǎn)突變體(CBL1G2A,第二位的甘氨酸定點(diǎn)突變?yōu)楸彼幔?。CBL1G2A無法正常定位到質(zhì)膜上,呈現(xiàn)彌散分布[18]。CBL9與CBL1的序列相似度超過89%,本研究采取了CBL9相似研究策略,并取得了相同的結(jié)果,即CBL9的N端保守位點(diǎn)的改變直接影響其正常的花粉管質(zhì)膜定位和功能發(fā)揮。CBL9定位異常的原因可能是由于其N-末端無法有效肉豆蔻酰化和棕櫚?;瑥亩绊懥薈BL9借助囊泡體系定位到花粉管質(zhì)膜的過程。

    除了花粉管極性生長(zhǎng)方面,序列高度相似的CBL1與CBL9的相關(guān)進(jìn)展主要體現(xiàn)在植物脅迫條件下的應(yīng)激反應(yīng)。例如低鉀條件下,CBL1與CBL9共同激活下游互作靶蛋白CIPK23,具備蛋白激酶活性的CIPK23再進(jìn)一步激活質(zhì)膜定位的鉀離子通道AKT1,從而提高了植株根系吸收鉀離子的能力。另外CBL1/9-CIPK23體系還可以通過磷酸化作用,激活硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)載體CHL1以應(yīng)對(duì)低氮脅迫[13]。盡管CBL1與CBL9在很多方面都體現(xiàn)出相似的生物學(xué)功能,但兩者的組織定位表現(xiàn)出明顯的差異。CBL1主要在葉及根中表達(dá),而CBL9則相對(duì)集中于花粉中(圖1)。由此推測(cè)CBL1可能主要在脅迫應(yīng)答方面發(fā)揮作用,而CBL9可能主要調(diào)控花粉管的極性發(fā)育。

    本研究中CBL9作為鈣離子感受器的一種類型,在花粉管的質(zhì)膜上呈現(xiàn)均勻分布狀態(tài),說明CBL9功能并不局限于一個(gè)特定的質(zhì)膜區(qū)域,而是可以在整個(gè)花粉管發(fā)揮它的功能。處于生長(zhǎng)狀態(tài)的花粉管中存在一個(gè)從頂端向下延展的鈣離子濃度梯度(2-10 μmol/L),鈣離子感受器CBL9作為分子開關(guān)的活性高低,可能取決于鈣離子在花粉管中不同質(zhì)膜區(qū)域的濃度。CBL下游存在一類蛋白激酶(CIPK),逆境脅迫研究揭示了一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的CBL-CIPK互作的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng):不同脅迫條件(鹽害、低溫等)誘導(dǎo)的鈣信號(hào)被不同的CBLs所感知,然后作用于不同的CIPKs,最終將逆境誘導(dǎo)產(chǎn)生的鈣信號(hào)按照不同方式傳遞下去,以完成植物不同的生理活動(dòng)需要。另外,一個(gè)CBL蛋白與不同CIPKs相互作用時(shí)可以顯示不同鈣離子濃度的依賴性[3,13,22]?;ǚ酃軜O性生長(zhǎng)過程中可能存在類似的調(diào)控體系:花粉管不同區(qū)域內(nèi)的不同鈣離子濃度被CBL9感應(yīng),進(jìn)而分別作用于下游不同的CIPKs,最終實(shí)現(xiàn)對(duì)花粉管頂端生長(zhǎng)的多方面調(diào)控功能?;ǚ酃茼敹松L(zhǎng)中的CBL-CIPK調(diào)控體系的建立,還有待CBL下游互作因子的進(jìn)一步發(fā)掘。

    4 結(jié)論

    CBL9主要定位于花粉管的質(zhì)膜,其過量表達(dá)造成花粉管的去極化生長(zhǎng),而N末端點(diǎn)突變體CBL9G2A無法定位到質(zhì)膜,并呈現(xiàn)正常的花粉管頂端生長(zhǎng)表型。CBL9的N末端在其亞細(xì)胞定位及功能發(fā)揮方面發(fā)揮一定的作用。

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