轉(zhuǎn)基因大豆RPA檢測技術(shù)的建立及應(yīng)用

竇雯 李尤 逯欣宇 錢雪梅 沈丹宇

（1. 南京外國語學(xué)校，南京 210008；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，南京 210095）

全球大規(guī)模商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因作物（Genetically modified crops，GMC）自從1996年以來已有20多年的時間，種植面積現(xiàn)已經(jīng)累計(jì)達(dá)到23億hm2，涉及大豆、玉米、棉花和油菜等多種作物［1-2］。而在我國允許商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物只有轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花和抗病毒番木瓜［3］。大豆是我國重要的糧食油料作物，同時大豆在榨油后的豆粕也是重要動物飼料來源［4］。我國是大豆消費(fèi)大國，需求量從1990年的1 100萬t增加到2015年的9 300萬t［5］。但我國種植的大豆總產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足國內(nèi)需求，從1996起就開始大規(guī)模進(jìn)口。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國大豆的進(jìn)口量從1996年的111萬t持續(xù)增加到2017年的近億噸，其中主要是從巴西、美國和阿根廷進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因大豆［6-7］。盡管目前中國還沒有開放轉(zhuǎn)基因大豆的商業(yè)化種植，但每年進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因大豆已經(jīng)占據(jù)了我國大豆市場的90%［8］。按照國家規(guī)定進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆只能作為榨油和飼料用途，而日常消費(fèi)直接食用的大豆為非轉(zhuǎn)基因大豆。因此，開發(fā)轉(zhuǎn)基因大豆的快速檢測方法對轉(zhuǎn)基因大豆的實(shí)時監(jiān)控具有重要意義。

所謂的轉(zhuǎn)基因大豆就是將所需的外源目的基因通過一定的途徑轉(zhuǎn)入到大豆基因組中，與基因組整合并能穩(wěn)定地遺傳和表達(dá)，從而改造大豆的生物學(xué)性狀［9］。目前轉(zhuǎn)基因大豆品種主要有抗除草劑、改良大豆油脂的、抗蟲的和復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因大豆［10］。耐除草劑大豆品種含有特異性的抗草甘膦、抗草胺磷或抗磺酰脲類等除草劑的目的基因，能夠高效地去除雜草又確保作物安然無恙［11］?？瓜x的轉(zhuǎn)基因大豆將蘇云金桿菌的殺蟲蛋白Bt基因或其他殺蟲基因轉(zhuǎn)入到大豆基因組中，使得這些轉(zhuǎn)基因大豆能夠有效地預(yù)防害蟲的發(fā)生。復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因大豆就是把以上兩個或幾個基因同時整合到大豆中［10］。由于這些轉(zhuǎn)基因大豆比非轉(zhuǎn)基因大豆具有出油率高和價格便宜等諸多優(yōu)勢，因此自1996年轉(zhuǎn)基因大豆商業(yè)化種植以來，全球轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積連年持續(xù)增加［12］，而我國轉(zhuǎn)基因大豆尚處于前期研究階段，并沒有實(shí)際的商業(yè)種植［13］。

根據(jù)檢測原理的不同，目前常用的轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)主要有兩大類：一類為蛋白水平的檢測方法，如免疫試紙條法、蛋白質(zhì)芯片和酶聯(lián)免疫吸附法等［14］；另一類為核酸水平上的鑒定方法，如PCR以及PCR相關(guān)的檢測技術(shù)，還有核酸雜交和基因芯片等方法［15］。蛋白質(zhì)水平的檢測是基于所轉(zhuǎn)的目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中得到了表達(dá)，通過檢測這些蛋白的存在來確定轉(zhuǎn)基因。由于這些鑒定方法只適用于新鮮的和未加工過的轉(zhuǎn)基因材料，并且當(dāng)轉(zhuǎn)入的基因表達(dá)量低時也無法檢測，因此這些方法并未得到廣泛采用。DNA水平上的檢測方法主要是基于PCR反應(yīng)，但這些檢測方法都需要熱循環(huán)PCR儀，實(shí)驗(yàn)程序復(fù)雜并且檢測時間較長，難以滿足非實(shí)驗(yàn)室條件下的快速篩查和檢測的需求［16］。最近幾年出現(xiàn)了恒溫條件下的等溫擴(kuò)增技術(shù)，其中研究較熱的一個技術(shù)就是環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）［17］。LAMP 檢 測 方法快速，能在恒溫65℃下完成整個反應(yīng)且實(shí)現(xiàn)了在反應(yīng)管中肉眼對反應(yīng)結(jié)果的判讀，已經(jīng)成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大豆的檢測，但仍然需要恒溫加熱設(shè)備［18］。

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase polymerase amplification，RPA）是2006年 Piepenburg等［19］研發(fā)出的一種等溫擴(kuò)增技術(shù)，它能在37-42℃恒溫條件下快速完成數(shù)十億DNA擴(kuò)增［20］。RPA反應(yīng)體系中主要包括重組酶（uvsX）、單鏈結(jié)合蛋白（Gp32）和鏈置換DNA聚合酶Bsu，其反應(yīng)原理不同于體外DNA復(fù)制的PCR技術(shù)，重組酶uvsX在常溫下就能打開DNA雙鏈進(jìn)行變性，因此不需要熱循環(huán)PCR儀［21-22］。RPA反應(yīng)技術(shù)靈敏度高，反應(yīng)快速，并且通過試紙條可以直接進(jìn)行觀察，方法簡便易行。因此，本文的目的是建立一個轉(zhuǎn)基因大豆的RPA快速檢測技術(shù)，利用試劑條顯色反應(yīng)實(shí)現(xiàn)肉眼鑒定樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，并對日常接觸到的大豆食品和種植的大豆進(jìn)行初步應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)中所需的引物由金斯瑞生物科技有限公司合成并提供。待檢測的豆芽、新鮮毛豆和大豆植株是隨機(jī)從市場購買或田間采集。作為陽性對照的轉(zhuǎn)基因大豆，含有花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子和根癌農(nóng)桿菌NOS終止子序列的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體pBinGFP2 DNA（50 ng/μL）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 大豆材料基因組DNA提取 各種大豆材料的基因組DNA提取均采用“DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒 ”（天根，北京，貨號DP320），并按使用說明書操作。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和反應(yīng)產(chǎn)物的檢測 PCR試劑盒購自諾唯贊（Vazyme），貨號為P505-d1/d2/d3。50 μL 反應(yīng)體系中包括 25 μL 2×Phanta Max Buffer、1 μL dNTP Mix、1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、2 μL DNA 模板，10 μmol/L 上下游引物各 2.0 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?：95℃ 預(yù)變性 3 min；95℃變性15 s，63℃退火 15 s，72℃延伸 30 s，35次循環(huán)；72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取出PCR 管，對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2% 瓊脂糖電泳檢測。

1.2.3 RPA引物的設(shè)計(jì) 現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因作物中大都有花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子和根癌農(nóng)桿菌NOS終止子［10］，通過對這些保守DNA序列分析可以設(shè)計(jì)RPA引物。RPA引物長度一般在30-35 nt，擴(kuò)增片段長度最好在100-200 bp，利用Primer3軟件（http：//primer3.ut.ee/），設(shè)計(jì)了5對RPA引物用作RPA試劑條引物的初步篩選（表1）。

表1 RPA試劑條檢測引物設(shè)計(jì)及序列

1.2.4 RPA試劑條引物和探針設(shè)計(jì) RPA反應(yīng)體系包括一對特異性引物和一條nfo探針，其中下游引物修飾有生物素B，nfo探針修飾有fluorescein isothiocyanate熒光素FITC。根據(jù)Nos終止子以及Nos163引物的序列，我們設(shè)計(jì)了Nos163的RPA引物和探針，序列見表2。如果反應(yīng)體系中的模板DNA為轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物會含有生物素B和FITC，擴(kuò)增產(chǎn)物通過毛細(xì)作用從試紙條的加樣點(diǎn)由下而上流動時，試紙條上會顯現(xiàn)control band 和test band兩條條帶。當(dāng)為非轉(zhuǎn)基因模板DNA或其他DNA時，試紙條上只顯示control band一條帶。

1.2.5 RPA試劑條檢測反應(yīng) RPA試劑盒（TwistAmp nfo）和 Milenia Hybridtech 1 strips（no nfo kits）試紙條均購自南京沃博生物科技有限公司，貨號分別為TANFO02KIT和MILENIA01。RPA反應(yīng)體系按試劑盒說明書進(jìn)行混合，為了保證反應(yīng)同時進(jìn)行，2.5 μL 280 mmol/L醋酸鎂溶液應(yīng)該最后加在八連管的蓋子上，小心翻轉(zhuǎn)蓋上，然后上下顛倒八連管混勻，離心。整個操作過程要在冰上進(jìn)行。RPA反應(yīng)在39℃恒溫下反應(yīng)4 min后，取出反應(yīng)管進(jìn)行渦旋震蕩，點(diǎn)動離心，再在39℃恒溫下反應(yīng)26 min，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物滴加至試紙條檢測區(qū)，再將95 μL試紙條檢測buffer加入到1.5 mL EP管中，最后將試紙條垂直放入試紙條檢測buffer中，以質(zhì)控線出現(xiàn)明顯條帶即可，3 min左右，待試紙條晾干后拍照。

表2 轉(zhuǎn)基因大豆的RPA試紙條引物和探針序列

2 結(jié)果

2.1 PCR篩選特異性RPA引物

為了篩選特異性且擴(kuò)增效率高的RPA檢測引物，我們首先利用常規(guī)PCR技術(shù)對5對RPA引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，陽性對照模板DNA為含有CaMV35S啟動子和NOS終止子的質(zhì)粒載體pBinGFP2 DNA（50 ng/μL），陰性對照采用超純水。如圖1所示，引物35s266和35s157對pBinGFP2 DNA擴(kuò)增出兩條或兩條以上的條帶（3和9），但從水中也擴(kuò)增出條帶（4），說明有污染。Nos183擴(kuò)增的產(chǎn)物條帶（1）較弱擴(kuò)增效率低，且陰性對照條帶有污染（2）。而Nos156和Nos163引物條帶清晰（5和7）且沒有污染（6和8），說明用Nos156和Nos163引物擴(kuò)增DNA反應(yīng)特異性強(qiáng)能夠產(chǎn)生單一的條帶，且擴(kuò)增效率高，產(chǎn)物濃度高，因此選擇這2對引物進(jìn)行后續(xù)的RPA檢測。

圖1 五對RPA引物的常規(guī)PCR檢測

2.2 PCR檢測RPA引物靈敏度

為了進(jìn)一步檢測引物Nos156和Nos163反應(yīng)的靈敏性，分別利用稀釋后不同濃度的質(zhì)粒pBinGFP2DNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，如圖2所示引物Nos163的PCR反應(yīng)比Nos156更為敏感，在相同template DNA濃度下，PCR條帶更為明顯，因此我們最終選擇Nos163引物用來設(shè)計(jì)RPA試劑條。

圖2 引物Nos156和Nos163的PCR靈敏度檢測

2.3 RPA試劑條檢測體系的建立與優(yōu)化

2.3.1 RPA檢測反應(yīng)體系的簡單優(yōu)化

為了進(jìn)一步優(yōu)化RPA反應(yīng)體系，以質(zhì)粒載體pBinGFP2作為模板DNA進(jìn)行了不同溫度和反應(yīng)時間的試劑條檢測，如圖3-A所示，RPA體系反應(yīng)溫度為25-45℃，但最合適的反應(yīng)溫度為大約40℃。反應(yīng)時間圖3-B所示從10 min-50 min都可以進(jìn)行，最適合的反應(yīng)時間大約為40 min。

圖3 RPA反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的優(yōu)化

2.3.2 RPA體系與常規(guī)PCR靈敏度的比較 以轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA作為模板，反應(yīng)溫度為39℃，時間為40 min進(jìn)行RPA反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4-A所示隨著模板DNA濃度的降低，RPA條帶濃度逐漸減弱，當(dāng)模板DNA濃度從100 pg-100 ag 時，RPA方法都能檢測出轉(zhuǎn)基因DNA。利用同樣濃度的轉(zhuǎn)基因大豆DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖4-B所示，只有DNA為1 ng時PCR才能檢測出轉(zhuǎn)基因DNA的存在。PCR和RPA方法比較說明RPA反應(yīng)靈敏度更高，在模板DNA濃度微量時（＜ 1 ng）RPA檢測比PCR方法具有顯著的檢測優(yōu)勢。

2.4 RPA檢測體系的實(shí)際應(yīng)用

為驗(yàn)證上述RPA技術(shù)的實(shí)用性，選取市場銷售的豆芽菜，新鮮毛豆夾以及田間采摘的大豆樣品共6種材料進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)過程中以2株已確定轉(zhuǎn)基因的大豆作為陽性對照和1株已知非轉(zhuǎn)基因大豆為陰性對照，結(jié)果（圖5-A）顯示，兩株轉(zhuǎn)基因大豆（Transgenic1和2）均顯示明顯的兩條帶，為陽性，而非轉(zhuǎn)基因大豆（WT）只有一條帶，為陰性。所有的大豆樣品均為陰性，顯示為非轉(zhuǎn)基因，說明南京周邊檢測到的市售大豆新鮮產(chǎn)品和種植的大豆沒有轉(zhuǎn)基因成分?，F(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因大豆檢測技術(shù)中最常用的為PCR，為了驗(yàn)證RPA檢測體系的準(zhǔn)確性，我們利用這些樣品進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果（圖5-B）顯示，只有兩株轉(zhuǎn)基因大豆（Transgenic 1和Transgenic 2）顯示為陽性，其他樣品均為陰性，此結(jié)果與RPA檢測相一致，進(jìn)一步證明RPA技術(shù)的可靠性。

圖4 RPA反應(yīng)體系與常規(guī)PCR靈敏度比較

圖5 RPA和PCR檢測豆芽菜和大豆樣品

3 討論

轉(zhuǎn)基因大豆的大量進(jìn)口和使用，對于緩解我國大豆短缺的問題具有重要意義，同時對進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆的監(jiān)控提出新的挑戰(zhàn)。為了防止轉(zhuǎn)基因大豆國內(nèi)的非法種植和流通，因此迫切需要簡便可行的轉(zhuǎn)基因大豆快速檢測方法。

現(xiàn)已建立的轉(zhuǎn)基因大豆檢測方法主要包括PCR和實(shí)時定量熒光PCR［25-26］。但這些方法都需要PCR儀或?qū)崟r定量熒光PCR儀以及瓊脂糖電泳，操作繁瑣，檢測過程長達(dá)幾個小時，不適合實(shí)時快速監(jiān)測。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法是近年來應(yīng)用較多的不依賴于復(fù)雜昂貴的儀器設(shè)備、簡便快速DNA檢測方法，并已應(yīng)用于大豆的檢測［27］。但環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法需60-65℃等溫條件，并要設(shè)計(jì)4種引物。根據(jù)現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因大豆檢測上的優(yōu)缺點(diǎn)和RPA技術(shù)不需要專門的儀器，常溫下能進(jìn)行目的基因特異性擴(kuò)增的優(yōu)勢，本研究設(shè)計(jì)建立轉(zhuǎn)基因大豆的RPA試劑條快速檢測技術(shù)，通過對不同濃度的轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法比常規(guī)PCR方法更靈敏，在微量的模板DNA濃度下（＜1 ng），PCR無法檢測時RPA也能檢測到轉(zhuǎn)基因DNA的存在。同時利用此方法對市場隨機(jī)購買的豆芽和毛豆樣品以及田間種植的大豆樣品進(jìn)行檢測，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆的存在，此結(jié)果和常規(guī)PCR檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步證明了本體系的可靠性和準(zhǔn)確性。與環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法相比本方法具有無需恒溫加熱儀器的優(yōu)點(diǎn)，RPA可以在25-45℃之間反應(yīng)，簡單的保溫杯或人體溫度甚至常溫就可以實(shí)現(xiàn)。同時RPA的引物設(shè)計(jì)簡單和PCR引物設(shè)計(jì)方法相似，無需復(fù)雜的分析，而環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法需要設(shè)計(jì)4種引物?？傊疚闹械霓D(zhuǎn)基因大豆RPA快速檢測方法具有常溫下反應(yīng)靈敏度高和結(jié)果可靠等優(yōu)勢，可以用于國內(nèi)大豆的監(jiān)控。

4 結(jié)論

本研究建立的轉(zhuǎn)基因大豆的RPA試劑條快速分子檢測方法，簡便易操作，無需PCR和電泳儀等昂貴的實(shí)驗(yàn)器材，檢測周期短，試劑條結(jié)果肉眼可見。應(yīng)用此方法初步檢測南京市田間和市場大豆，在待檢測的樣品中沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因成分。