雞 飼 料 中 拉 沙 洛 西 鈉 的 測 定

■金夢銘 程林麗 陳可心 丁宇麗

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京100193）

拉沙洛西鈉（Lasalocid sodium）是由拉沙洛鏈霉菌(Streptomyces lasaliensis)產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物拉沙洛西A 的鈉鹽。它是一種芳香聚醚類離子載體型抗生素類飼料添加劑[1]，根據(jù)我國農(nóng)業(yè)部公告168 號規(guī)定，采用75～125 mg/kg拉沙洛西鈉混飼的方法用于治療雞球蟲病。但是，飼料中添加拉沙洛西鈉劑量過大時會對動物產(chǎn)生毒性作用[2]，長期或過量使用還會產(chǎn)生藥物殘留超標(biāo)等問題。目前我國采取飼料中拉沙洛西鈉的測定——高效液相色譜法[3]作為檢測標(biāo)準(zhǔn)之一，但是由于該標(biāo)準(zhǔn)建立的年代過久，飼料樣品經(jīng)提取后直接上樣分析基質(zhì)干擾太大，靈敏度低，無法滿足現(xiàn)階段對飼料樣品監(jiān)控的需要。因此，本研究對該飼料檢測方法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行改進(jìn)，增加了樣品凈化的步驟并對其它各種條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了本檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和溶液

空白雞配合飼料、雞濃縮飼料和雞預(yù)混合飼料均由北京維德維康生物有限公司提供。拉沙洛西鈉標(biāo)準(zhǔn)品(Lasalocid，LAS：純度≥97%)購自Sigma公司。硅膠固相萃取柱（500 mg，6 ml），購自上海安普生物技術(shù)公司。正己烷-乙醚（50∶50，v/v）。二氯甲烷-甲醇（90∶10，v/v）、0.1%甲酸溶液、含0.1%甲酸的乙腈溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液（9∶1，v/v）、醋酸銨溶液（125 mmol/l）。1 000 μg/ml和100 μg/ml拉沙洛西鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液通過用甲醇配制或稀釋獲得。0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)工作液通過用乙腈-0.1%甲酸溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液獲得。

1.2 液相色譜檢測方法

采用Waters 2695 高效液相色譜儀進(jìn)行，配Waters 2475熒光發(fā)射檢測器。色譜柱為Shim-pack VPODS C18（4.6×250 mm，4.6 μm）色譜柱。流動相為乙腈-125 mmol/l 醋酸銨溶液（85∶15，v/v），等度洗脫。流速為1.0 ml/min。進(jìn)樣量為20 μl。激發(fā)波長為314 nm。發(fā)射波長為418 nm。柱溫為室溫。

1.3 樣品前處理方法

稱取試樣2.00 g（精確到0.02 g）于50 ml離心管中，加10 ml甲醇，渦動1 min，振蕩提取40 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液。殘渣中加10 ml甲醇，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，定容至20 ml。取2 ml 提取液于40 ℃氮氣吹至近干，加5 ml 正己烷通過渦動溶解殘渣，為試樣溶液。取硅膠固相萃取柱，用5 ml正己烷活化，在正己烷液面即將進(jìn)入柱床前，加入試樣溶液。用5 ml正己烷洗滌試樣溶液管，并將洗滌液全部通過固相萃取柱。再用8 ml正己烷-乙醚溶液淋洗小柱，最后用6 ml二氯甲烷-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，40 ℃氮氣吹干，加入乙腈-0.1%甲酸溶液1 ml，渦動1 min，過濾膜后供液相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性回歸分析

各取20～1 000 μg/l 的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液相色譜分析。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，藥物峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖1所示，在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)，藥物峰面積與濃度呈線性相關(guān)，線性回歸方程為y=614.3x+14 542，相關(guān)系數(shù)大于0.998。

圖1 拉沙洛西鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法的檢出限與定量限

取5個空白樣品在不加拉沙洛西鈉的基礎(chǔ)上按樣品前處理方法進(jìn)行處理后上機(jī)檢測，按信噪比S/N=3為檢測限（LOD），S/N=10為定量限（LOQ）測定方法確定檢出限和定量限。結(jié)果如表1所示，飼料中拉沙洛西鈉的檢出限為3.57～11.83 μg/kg，定量限為11.90～39.43 μg/kg。

表1 飼料中拉沙洛西鈉測定的LOD和LOQ

2.3 方法回收率及變異系數(shù)

取2.00 g（精確至0.01 g）空白雞配合飼料、雞濃縮飼料，以1、10、20、50、100 mg/kg；雞預(yù)混合飼料以1、10、50、100、200 mg/kg 濃度水平進(jìn)行五個濃度的添加回收試驗。每個濃度設(shè)5個平行，連續(xù)做3次，計算添加回收率、日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)(表2)，在四個濃度添加水平下，各種飼料中拉沙洛西鈉的平均回收率均滿足70%～120%；日內(nèi)變異系數(shù)均小于15%，日間變異系數(shù)均小于20%，表明該方法回收率高，穩(wěn)定性強(qiáng)，準(zhǔn)確度、精密度和重復(fù)性均符合我國對飼料檢測方法的要求。三種飼料相關(guān)色譜見圖2～圖4，由圖可知，在拉沙洛西鈉保留時間位置無色譜峰干擾。

表2 飼料中拉沙洛西鈉添加回收率及變異系數(shù)

2.4 色譜分析

本方法采用Shim-pack VP-ODS C18（250 mm×4.6 μm）色譜柱分析，采用甲醇提取樣品，樣品提取液加水稀釋后通過硅膠固相萃取柱凈化，以乙腈-125 mmol/l醋酸銨為流動相進(jìn)行等度洗脫分離。出峰時間在14.2 min左右。A為空白樣品，B為0.2 μg/ml拉沙洛西鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，C為混合拉沙洛西鈉的飼料空白樣品，在400 μg/kg的空白樣品添加回收試驗中，分別用配合飼料樣品、濃縮飼料樣品、預(yù)混合飼料樣品制備的空白樣品、添加拉沙洛西鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品和空白添加樣品進(jìn)行測試，色譜圖見圖2～圖4。根據(jù)同種飼料和混合飼料的三種樣品的色譜圖，可以明顯看出在藥物的保留時間處無雜峰干擾，色譜峰明顯。

3 討論

圖2 配合飼料樣品色譜

圖3 濃縮飼料樣品色譜

圖4 預(yù)混合飼料樣品色譜

拉沙洛西鈉為中等極性的疏水性物質(zhì),可采用極性溶劑、稀酸或緩沖液提取，經(jīng)離心后做進(jìn)一步凈化。文獻(xiàn)報道的方法多采用乙腈、酸化乙腈、甲醇和酸化甲醇進(jìn)行飼料樣品中拉沙洛西鈉的提取，也有少數(shù)方法采用弱堿性溶液提取[4-7]。這些檢測方法各有其特點，且方法論述詳盡，比較成熟。因此，實驗室對上述提取方法都進(jìn)行了試驗，最后采用甲醇作為提取溶劑。為了提高提取效率，實驗室采用兩次提取法，且每次提取時采用渦旋使飼料與甲醇充分接觸后，接著震蕩提取，使目標(biāo)藥物充分滲出。

從表1、表2的數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，本方法的回收率高、精密度好，可重復(fù)性強(qiáng)，同時符合經(jīng)濟(jì)實用的要求。從圖2～圖4 的空白樣品和添加藥品樣品的色譜圖可以看出，色譜保留時間處均無任何雜峰干擾，說明各種雞飼料中的雜質(zhì)對本文采取的測定方法無任何干擾。這說明本方法能夠滿足各種雞飼料中拉沙洛西鈉的測定。

4 結(jié)論

本研究建立了雞飼料拉沙洛西鈉測定的高效液相色譜法。在五個藥物添加濃度水平下，三種飼料中拉沙洛西鈉的平均回收率均滿足79%～89%；日內(nèi)變異系數(shù)均小于12%，日間變異系數(shù)均小于12%。本方法準(zhǔn)確、高效、靈敏，適用于對各種雞飼料中拉沙洛西鈉的測定。