飼料蛋白酶的最新研究與應(yīng)用進展

■于書坤

(杜邦營養(yǎng)與生物科學(xué)研發(fā)中心，丹麥奧胡斯DK-8220)

蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪是三種主要的常量營養(yǎng)元素，可提供動物生長所需的能量和必需營養(yǎng)物質(zhì)。以蛋白質(zhì)為例，必需的營養(yǎng)元素是氨基酸，它也是機體和所有生物代謝過程中必需的。動物可產(chǎn)生內(nèi)源蛋白酶來消化蛋白質(zhì)，例如胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶是最主要的內(nèi)源蛋白酶。一般來說，內(nèi)源蛋白酶對飼料蛋白的消化效率為80%～90%，因此，添加外源蛋白酶可起到輔助補充作用，進一步提高蛋白質(zhì)的消化率。在豬禽營養(yǎng)中，高效的蛋白質(zhì)消化率可以更有效、更充分的實現(xiàn)飼料原料的應(yīng)用價值，保證生產(chǎn)效率，維持腸道健康和減少環(huán)境中氨氮的排放。除了對蛋白質(zhì)營養(yǎng)的貢獻外，蛋白酶也可以協(xié)助釋放其它養(yǎng)分（如淀粉、脂肪和礦物質(zhì)）、降解蛋白類抗?fàn)I養(yǎng)因子和抗原（如植物凝集素、伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子）。抑制上述抗原類所誘導(dǎo)的不必要的耗能免疫反應(yīng)，降低未被動物消化的養(yǎng)分水平。并且，通過增加蛋白質(zhì)的消化率，蛋白酶還可以降低到達胃腸道（GIT）后段的蛋白質(zhì)含量，從而減少有害微生物的發(fā)酵底物。

1 偏堿性蛋白酶更廣泛的底物特異性與動物內(nèi)源蛋白酶具有互補作用

蛋白質(zhì)是氨基酸多聚體，由20 種不同的天然氨基酸組成。對于活的生物體來說，氨基酸是最重要的生命建筑基石。氨基酸之間通過肽鍵連接起來形成聚體稱作肽。根據(jù)肽其長短可以分為短鏈肽（寡肽，由2～3 個氨基酸組成的二肽和三肽）、中鏈（多肽）和長鏈肽（即蛋白）。蛋白酶的作用即通過水解連接氨基酸的肽鍵，降解蛋白質(zhì)至多肽和寡肽甚至游離的氨基酸。動物攝入的飼料蛋白質(zhì)首先在胃腸道被水解成中鏈多肽，然后進一步水解成寡肽、三肽、二肽或者游離氨基酸。游離氨基酸、二肽和三肽均可以直接被小腸吸收，其途徑是通過小腸上皮細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運子，最終進入血液循環(huán)。

胃腸道（也稱消化道）中第一個對飼料蛋白質(zhì)進行水解的蛋白酶即是胃蛋白酶。胃蛋白酶是由胃（豬）或者腺胃（禽）中分泌的。它屬于酸性蛋白酶，分泌后在pH 值5.0 以下激活并表現(xiàn)活力，在低pH 值環(huán)境中活性最高。胃蛋白酶具有廣泛的底物特異性，但是，研究表明，與偏堿性蛋白酶相比，它對于三個堿性氨基酸（賴氨酸、精氨酸和組氨酸）旁的肽鍵水解效率不高（表1）。另外，盡管胃蛋白酶具有廣泛的底物特異性，但是，由于飼料蛋白質(zhì)在胃中的有限停留時間，以及在低pH值下并不是所有蛋白質(zhì)都能有效地發(fā)生水合作用和被溶解，因此，在這里飼料蛋白質(zhì)并不能很好的被水解。

在小腸中，pH 值由酸性轉(zhuǎn)化為更接近中性和堿性水平，且有膽汁酸表面活性劑的協(xié)助，使得一些飼料蛋白質(zhì)的溶解性發(fā)生改變，但是，同時也降低了胃蛋白酶的效率。因此，這就需要動物體分泌一組新的蛋白消化酶。通過胰腺分泌至腸道的胰液中包含胰蛋白酶、糜蛋白酶和彈性蛋白酶，它們的最適pH值與小腸的酸堿度吻合。與胃蛋白酶不同，胰腺分泌的這些蛋白酶底物特異性比較狹窄，眾所周知，胰蛋白酶只水解堿性氨基酸賴氨酸和精氨酸旁的肽鍵（表1）；糜蛋白酶比較偏重于水解大分子的疏水性氨基酸旁的肽鍵，如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸及亮氨酸；胰彈性蛋白酶則更喜歡水解含有小的疏水側(cè)鏈的氨基酸旁的肽鍵，如丙氨酸、纈氨酸及亮氨酸。盡管從整體考量這三種蛋白酶一起作用，底物特異性范圍也較廣，但是，值得注意的是，胰蛋白酶是胰腺分泌的主要的蛋白酶，糜蛋白酶的分泌量大約只有它的50%，彈性蛋白酶的量更少。換言之，胰腺分泌的蛋白酶更傾向于水解賴氨酸和精氨酸旁的肽鍵，而不是水解蛋白中所有的肽鍵。

表1 動物內(nèi)源消化酶和偏堿性蛋白酶水解蛋白質(zhì)肽鍵的偏好性(%)

偏堿性蛋白酶是一種具有廣泛底物特異性，細(xì)菌來源的單一組分內(nèi)切飼料蛋白酶。它在小腸的pH值條件下可以高效工作，在中性和堿性pH 值范圍內(nèi)活性最高，在胃腸道前段pH 值3～4.5 條件下，它仍然具有較高的酶活水平。例如，基于液譜質(zhì)譜（LC-MS）儀檢測的所產(chǎn)生的多肽和寡肽的總數(shù)量，偏堿性蛋白酶在pH值3.7時與豬胃蛋白酶純酶等重量的基礎(chǔ)上，仍然具有大約豬胃蛋白酶純酶40%的活性。其廣泛的底物特異性表明，它與胃蛋白酶和其它三種胰腺分泌的蛋白酶具有肽鍵水解功能互補性（表1）。這是由于該偏堿性蛋白酶不僅可以水解胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和彈性蛋白酶所能水解的肽鍵，而且它還可以水解以上四種蛋白酶比較不易水解的肽鍵（表1）。

植物來源的蛋白質(zhì)往往富含酸性氨基酸，即天冬氨酸和谷氨酸以及它們的酰胺衍生物，如天冬酰胺和谷氨酰胺（表2）。但是，胰腺分泌的蛋白酶不易水解由這些氨基酸組成的肽鍵，而偏堿性蛋白酶可以對其進行有效水解（表1）。除了對天冬氨酸和谷氨酸表現(xiàn)高酶活外（表2），比較于豬胰蛋白酶，在底物為還原牛血清白蛋白（BSA）和大豆分離的全蛋白，pH 值6.5 條件下，LC-MS 檢測結(jié)果表明偏堿性蛋白酶對苯丙氨酸、組氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸和酪氨酸這6 種氨基酸旁的肽鍵都具有比較高的活性（見表1）。本文所用豬胰蛋白酶（Sigma P7545）是一組胰腺分泌的中堿性消化酶混合物，包含內(nèi)切的胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶和外切的蛋白酶（羧肽酶A，B）及胰淀粉酶、胰脂肪酶等。

表2 動物飼料中主要蛋白原料（豆粕和菜籽粕）和谷物（玉米和小麥）的氨基酸組成（%）

表2 （續(xù)） 動物飼料中主要蛋白原料（豆粕和菜籽粕）和谷物（玉米和小麥）的氨基酸組成（%）

2 偏堿性蛋白酶產(chǎn)物為可消化小肽

偏堿性蛋白酶除了上述提到的具有廣泛的底物特異性之外，體外實驗結(jié)果還表明，它可以更早地水解飼料原料中的蛋白質(zhì)，即在胃和腸道前段（如家禽的嗉囊、腺胃和肌胃以及豬的胃中）釋放小肽和被包被的養(yǎng)分。在胃和上消化道（十二指腸）低pH值（例如pH值3.7）條件下，偏堿性蛋白酶與豬胃蛋白酶在等重量基礎(chǔ)上，水解底物產(chǎn)生分子量小于3 500道爾頓的小肽的量接近（圖1A）。假如在胃和腸道前段即可更早地發(fā)揮蛋白質(zhì)水解活性，則可以通過水解反應(yīng)快速處理掉蛋白類抗?fàn)I養(yǎng)因子，降低對蛋白質(zhì)消化的負(fù)影響，從而優(yōu)化了水解蛋白質(zhì)底物的時間。我們最新的數(shù)據(jù)顯示，在小腸pH值6.5的條件下，基于LC-MS 檢測的所產(chǎn)生的多肽和寡肽的總數(shù)量，在等重量基礎(chǔ)上比較，以水解產(chǎn)生的寡肽、多肽的總量為標(biāo)準(zhǔn)，偏堿性蛋白酶具有豬胰蛋白酶2.8倍的活性，可以水解產(chǎn)生1.7倍于豬胰蛋白酶分子量小于1 100～1 200道爾頓的“可消化小肽”（圖1B）。可消化小肽是指是由10個或少于10個氨基酸殘基組成的，分子量小于1 200道爾頓的寡肽。它們更易擴散入腸道表面的黏膜層，進而被小腸刷狀緣結(jié)合的寡肽酶降解成可直接吸收的二肽和三肽。

3 偏堿性蛋白酶獨特作用方式

不同于其它蛋白酶，偏堿性蛋白酶的作用方式很獨特；它不會與胃蛋白酶、胰蛋白酶和其它胰腺分泌的動物內(nèi)源蛋白酶在蛋白水解方面產(chǎn)生競爭，而是與這些內(nèi)源蛋白酶產(chǎn)生互補作用。

由于偏堿性蛋白酶具有不同的底物特異性（見表1），與胃蛋白酶和胰腺分泌蛋白酶相比，基于水解多肽位點的差異可產(chǎn)生一組不同的小肽。

基于純的酶蛋白特性，盡管偏堿性蛋白酶最優(yōu)作用范圍在偏堿性pH值范圍，以水解產(chǎn)生的寡肽、多肽的總量為標(biāo)準(zhǔn)，它在胃環(huán)境中仍具有約豬胃蛋白酶40%的活性，可產(chǎn)生類似數(shù)量的可消化小肽（圖1A）。

我們最新的數(shù)據(jù)顯示，偏堿性蛋白酶和豬胰腺分泌的蛋白酶在小腸環(huán)境中所產(chǎn)生的可消化小肽的量，前者超過后者70%(圖1B)。

偏堿性蛋白酶不受植物源蛋白類酶抑制因子的影響，而胰蛋白酶和糜蛋白酶均會受抑制因子影響，這是因為它們可以和這些抑制劑形成難解離的復(fù)合物，如，大豆胰蛋白酶抑制因子(STI)和大豆胰蛋白酶-糜蛋白酶抑制因子(STCI)(圖2)。植物源蛋白類酶抑制因子不僅富集于大豆中，也同樣存在于其它植物性飼料原料中。

圖1 液相色譜/質(zhì)譜（LC/MS）聯(lián)用分析

圖2 飼料中內(nèi)源抑制劑對胰蛋白酶和偏堿性蛋白酶活力的影響

在一定程度上，偏堿性蛋白酶可以降解這些植物源蛋白類抑制因子、植物凝聚素等抗?fàn)I養(yǎng)因子，從而降低這些抗?fàn)I養(yǎng)因子對飼料蛋白消化吸收的負(fù)面作用。

4 偏堿性蛋白酶不僅表現(xiàn)在提高蛋白質(zhì)的消化率

眾所周知，植酸酶具有“超越釋放植酸磷”的作用，飼用蛋白酶也證明具有“超越降解蛋白”的效果。除了提高蛋白質(zhì)氨基酸的消化率外，偏堿性蛋白酶也可提高飼料中淀粉、脂肪和包括纖維等結(jié)構(gòu)性碳水化合物的消化率。這是因為在飼料中不同的養(yǎng)分之間存在著緊密的結(jié)構(gòu)聯(lián)系。例如谷物中的淀粉顆粒常常被貯存蛋白包被，油脂（甘油三酯）以脂肪體的形式貯存，外周是以蛋白質(zhì)和磷脂組成的膜包裹（圖3）。

以玉米為例，淀粉分布在胚乳的兩個區(qū)域，角質(zhì)區(qū)域和粉質(zhì)區(qū)域（圖3A）。較粉質(zhì)區(qū)域，角質(zhì)區(qū)域的淀粉顆粒更緊實的結(jié)合在淀粉-蛋白基質(zhì)上（圖3B，3C）。很明顯，包被玉米淀粉粒的蛋白質(zhì)（玉米醇溶蛋白、白蛋白、球蛋白、谷蛋白）須先降解，淀粉酶才能進而水解淀粉。植物細(xì)胞中包被脂肪體的結(jié)構(gòu)蛋白叫做油脂蛋白（圖3D）。

5 偏堿性蛋白酶與內(nèi)源蛋白酶以及其它飼料酶均具有互補協(xié)同作用

本質(zhì)上所有的飼料酶都是蛋白質(zhì)，因此，檢測外源蛋白酶對飼料酶（如植酸酶、木聚糖酶和淀粉酶）的影響是非常重要的。在體外高濃度條件下，我們實驗室對這些飼料酶之間的相互作用進行了廣泛的測試，結(jié)果表明偏堿性蛋白酶對所測飼料酶，如木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶以及動物內(nèi)源胃蛋白酶和胰蛋白酶都沒有負(fù)作用。盡管如此也需注意，即高濃度的液體蛋白酶產(chǎn)品在與飼料混合之前不應(yīng)該與其它飼料酶預(yù)混。

圖3 蛋白、淀粉和脂肪之間的結(jié)構(gòu)特點

偏堿性蛋白酶添加到飼料中，可與動物體內(nèi)源胃蛋白酶和胰蛋白酶產(chǎn)生協(xié)同作用。我們的研究表明偏堿性蛋白酶也可與木聚糖酶產(chǎn)生協(xié)同作用提高蛋白的釋放量，這主要是由于谷物中某些蛋白和結(jié)構(gòu)碳水化合物的緊密聯(lián)系。

6 偏堿性蛋白酶在家禽和豬上的生物學(xué)效率

任何飼料酶產(chǎn)品的效果都是通過動物的生長性能來表現(xiàn)的。偏堿性蛋白酶在肉雞和豬的日糧中都進行了測試，結(jié)果表明均可顯著改善動物的生長性能（圖4）。在1～42 d肉雞試驗中，負(fù)對照（NC）飼喂氨基酸和能量缺乏的玉米豆粕型日糧，在此基礎(chǔ)上添加偏堿性蛋白酶可以顯著降低料肉比（FCR）4.1%，顯著提高體增重（BWG）60～70 g/只。在25～65 kg 生長豬的試驗中，飼喂添加副產(chǎn)品的玉米豆粕型日糧，添加偏堿性蛋白酶顯著降低FCR 6.9%，BWG無顯著差異，表明偏堿性蛋白酶提高了飼料利用效率。

圖4 偏堿性蛋白酶對肉雞和生長豬生長性能的影響

7 展望

隨著世界人口的不斷增加，消費者對動物蛋白質(zhì)的需求也在不斷增加，生產(chǎn)商將會更加關(guān)注生產(chǎn)效率。由于飼料原料質(zhì)量和價格的差異性和浮動性，成本效益將永遠(yuǎn)是重中之重。就動物蛋白生產(chǎn)的長期可持續(xù)性而言，環(huán)境管理也是重要的影響因素。在這些前提下，飼料蛋白酶將發(fā)揮非常重要的作用：提高飼料原料的價值；提高飼料原料中氮的存留；改善動物生產(chǎn)對環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的負(fù)影響，最終提高生產(chǎn)效率和生產(chǎn)商的利潤。偏堿性蛋白酶作為飼料蛋白酶的一種，它的功能與內(nèi)源蛋白酶，無論是酸性胃環(huán)境中的胃蛋白酶，還是中性堿性腸道環(huán)境中的胰蛋白酶、糜蛋白酶和彈性蛋白酶，都具有很好的互補性，可以更好的協(xié)同發(fā)揮蛋白酶的作用。