甲型H1N1流行性感冒患者中miRNAs的表達(dá)研究

馬振莉

流行性感冒(流感)是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的流行性疾病之一，它是一種甲型流感病毒感染而致的呼吸道傳染病。流感病毒分為甲(A)、乙(B)和丙(C)三型[1,2]。其中，甲型H1N1流感病毒變異能力強(qiáng)、危害大，患者通常出現(xiàn)全身酸痛、咳痰、咽痛、發(fā)熱、胸痛、乏力、鼻塞等流感樣癥狀，少數(shù)患者可出現(xiàn)合并呼吸衰竭、肺炎，最終死亡[3]。甲型H1N1流行性感冒主要通過空氣飛沫傳播和患者分泌物傳播，傳染性強(qiáng)、發(fā)病率高，易在學(xué)校、醫(yī)院、幼兒園等人員密集場所引起暴發(fā)流行或大流行[4]。據(jù)統(tǒng)計，每幾十年或幾年就會發(fā)生全球性或地區(qū)性的甲型流行性感冒，每年有數(shù)百萬人會發(fā)生甲型流行性感冒，給社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展和公共衛(wèi)生安全帶來巨大的威脅[5,6]。目前，臨床缺乏診斷、預(yù)測和預(yù)防甲型流行性感冒的有效方法和指標(biāo)，因此，本實驗研究2017年3月至2018年6月期間于我院就診的甲型H1N1流行性感冒患者中miRNAs的表達(dá)水平，為抵御甲型流感病毒提供新思路。

1.資料與方法

1.1 一般資料 將2016年3月至2018年6月期間于我院就診的168例患者作為本實驗的研究對象，根據(jù)原衛(wèi)生部發(fā)布的《甲型HlN1流感診療方案(2009年第三版)》甲型HlN1流感的診斷標(biāo)準(zhǔn)及《全國流感監(jiān)測方案(2010年版)》中流感樣病例的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將168例患者分為甲型H1N1流感患者組(n=86)和對照組(n=82)。

本研究病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡范圍為18～65歲；②發(fā)熱≥37.5℃；③至少具有兩個下列癥狀：鼻塞、咽喉痛、咳嗽、肌痛、乏力、頭痛、寒戰(zhàn)或出汗；④自愿參與本課題，并簽署書面知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有癡呆或其他精神科疾??；②懷孕或哺乳婦女；③實驗室檢查有細(xì)菌感染的高度可能性；④合并心肺、肝腎功能異常、凝血功能障礙或其他先天性重大疾病。

1.2 血清樣本的采集 采用EDTA抗凝管收集甲型H1N1流感患者組及對照組人員空腹肘部靜脈血4ml，現(xiàn)場編號并詳細(xì)記錄患者姓名和一般情況。隨后，12000r/min常溫離心10min，將上清液收集于無RNA酶的進(jìn)口EP管中，置于 -80℃保存，以備提取RNA。此外，在甲型H1N1流感患者接受治療前及治愈出院時均抽取患者空腹肘部靜脈血4ml，同樣方法處理血液樣品，并保存。

1.3 總RNA提取 血清樣本中總RNA的提取采用TRIzol試劑盒(Invitrogen，美國)，按說明書進(jìn)行操作。取血清標(biāo)本，加入1ml Trizol試劑，充分混勻，并加入200μl氯仿。振蕩混勻，室溫靜置10min后，置于4℃低溫離心機(jī)，12500r/min離心15min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一EP管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，12000r/min離心10min。棄掉上清，在剩余的RNA沉淀中加入DEPC水。提取的總RNA經(jīng)Nanodrop儀器(Thermo，美國)檢測A260/A280值，當(dāng)比值在1.8～2.0時可用于后續(xù)步驟。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR實驗 采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI，美國)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，選擇德國羅氏逆轉(zhuǎn)錄儀進(jìn)行該反應(yīng)。并采用已制備的cDNA、蒸餾水、引物、SYBR試劑(羅氏，德國)進(jìn)行實時熒光定量PCR操作。反應(yīng)條件：50℃預(yù)熱2min，95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃退火1min，72℃延伸30s，40個循環(huán)，記錄并統(tǒng)計各個樣本的循環(huán)數(shù)(CT值)。按照2-△△CT法，以U6為內(nèi)參，檢測miRNAs的相對表達(dá)變化。本實驗中所有引物序列詳見表1。

表1 所有引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。組間比較采用t檢驗。當(dāng)P<0.05時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 兩組患者血清中miRNAs的表達(dá)水平 收集對照組和甲型H1N1流感患者組血清樣本，檢測miR-101、miR-196a-5p、miR-203、miR-21、miR-221、miR-24、miR-27a、miR-326、miR-502的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，miR-196a-5p、miR-21和miR-221在甲型H1N1流感患者血清中表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0376，0.0027，0.0096)，其中miR-21的表達(dá)升高最為顯著。如圖1所示，miR-203、miR-502在甲型H1N1流感患者血清中表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0011，0.0050)(圖1)，其中，niR-502的表達(dá)降低最為顯著。此外，miR-101、miR-221、miR-24、miR-27a、miR-326、在對照組和甲型H1N1流感患者血清中無差異性表達(dá)。

注：*P<0.05,**P<0.01。圖1 兩組患者血清中mRNAS的表達(dá)對比

2.2 甲型H1N1流感患者治療前后血清中miRNAs的表達(dá)變化 收集甲型H1N1流感患者治療前及治愈出院時血清樣本，進(jìn)一步檢測miR-196a-5p、miR-203、miR-21、miR-221、miR-502在甲型H1N1流感患者接受治療前后的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，miR-196a-5p、miR-203、miR-221、miR-502在甲型H1N1流感患者治療前后血清中的表達(dá)并沒有顯著差異(圖2)。與治療前相比，miR-21在甲型H1N1流感患者治療后顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0472)，見圖2。

注：*P<0.05。圖2 甲型H1N1流感患者治療后血清mRNAS的表達(dá)變化

3.討論

甲型H1N1流行性感冒是一種全世界流行的傳染性較強(qiáng)的呼吸系統(tǒng)疾病，目前缺乏早期預(yù)測、診斷和治療的生物指標(biāo)，且臨床缺乏有效的抗流感病毒藥物[7]。miRNAs是一種長度約為18～25個核苷酸的非編碼小RNA分子，其能夠調(diào)控靶基因的降解或抑制靶基因的表達(dá)，進(jìn)而參與大多數(shù)真核生物生命進(jìn)程[8]。據(jù)報道，miRNAs在宿主與病毒相互作用中發(fā)揮了重要作用。因此，我們探討miRNAs是否可以成為抗流感病毒的新靶點。

本研究通過收集對照組患者和甲型H1N1流行性感冒患者的血清，研究miRNAs在兩組患者血清中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-21在甲型H1N1流行性感冒患者血清中顯著升高。進(jìn)一步研究表明，與治療前相比甲型H1N1流行性感冒患者治療后miR-21的表達(dá)顯著降低，因此miR-21可能與甲型H1N1流行性感冒的發(fā)生和發(fā)展有密切聯(lián)系，但其具體機(jī)制和作用有待繼續(xù)研究。

本研究通過檢測甲型H1N1流行性感冒患者血清中miRNAs的表達(dá)，證明miR-21可能參與甲型H1N1流行性感冒的發(fā)生和發(fā)展，為早期診斷、預(yù)測、預(yù)防和治療甲型H1N1流行性感冒提供新思路。